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Artigo de método

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

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DOI:

10.3791/2797

⸱

10 de outubro de 2011

 ,  , 
1Department of Genetics, University of Georgia

Neste artigo

Resumo

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Resumo

A hibridização in situ em preparação inteira é uma abordagem muito informativa para definir os padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, com múltiplas etapas importantes que conjuntamente contribuem para a qualidade do resultado final. Este protocolo descreve em detalhes várias etapas-chave de controle de qualidade para otimizar a marcação e o desempenho da sonda. De modo geral, nosso protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas críticas necessárias para obter resultados de alta qualidade de forma reprodutível. Primeiramente, descrevemos a geração de sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) por meio de transcrição in vitro de modelos de DNA gerados por PCR. Descrevemos três ensaios críticos de controle de qualidade para determinar a quantidade, a integridade e a atividade específica das sondas marcadas com DIG. Essas etapas são importantes para gerar uma sonda com sensibilidade suficiente para detectar RNAm endógenos em um embrião inteiro de camundongo. Além disso, descrevemos métodos para a fixação e o armazenamento de embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias para hibridização in situ. Em seguida, descrevemos métodos detalhados para digestão limitada com proteinase K dos embriões reidratados, seguidos pelos detalhes das condições de hibridização, lavagens pós-hibridização e tratamento com RNase para remover a hibridização não específica da sonda. Um anticorpo conjugado à fosfatase alcalina (AP) é utilizado para visualizar a sonda marcada e revelar o padrão de expressão do transcrito endógeno. Resultados representativos são apresentados a partir de experimentos bem-sucedidos e de experimentos típicos subótimos.

Protocolo

1. Geração de riboprobes por transcrição in vitro

  1. Preparação de produtos de PCR para uso como modelos de transcrição in vitro.
    1. Projete os iniciadores de PCR com sequências promotoras de transcrição de fagos nas extremidades 5'.
      Observação: A sequência promotora adicionada à extremidade 5' do iniciador de PCR da fita sentido será usada para transcrever a sonda sentido, e a sequência promotora adicionada à extremidade 5' do iniciador de PCR da fita antissenso será usada para sintetizar a sonda antissenso1-3. Não detectamos diferença na eficiência de transcrição entre modelos que contêm apenas as sequências promotoras centrais e modelos que contêm o promotor central mais sequências adicionais na extremidade 5'. Este método tem sido usado com os promotores de fagos T3, T7 e SP6.
      Devem-se evitar sequências altamente conservadas entre membros da família gênica ou sequências altamente repetitivas, pois podem resultar em hibridização inespecífica e, consequentemente, aumentar a coloração de fundo. Sondas com alto teor de GC terão incorporação limitada de digoxigenina-rUTP, e sequências de DNA com trechos contínuos de resíduos de T limitarão a incorporação de dig-UTP devido à interferência estérica entre as moléculas de digoxigenina. O comprimento da sonda pode variar de 300 pb a 1 kb. Contudo, desde que os critérios acima sejam atendidos, geralmente sondas mais longas apresentam atividades específicas mais altas.
    2. O modelo para a PCR pode ser um clone plasmidial, um clone genômico ou DNA genômico. Normalmente adquirimos clones EST completos (por exemplo, da ATCC ou Open Biosystems) para usar como modelos de PCR. Amplifique o DNA modelo usando procedimentos padrão de PCR para produzir um produto de PCR contendo as sequências promotoras. Para obter quantidade suficiente de modelos de sonda para suportar várias reações de síntese de sonda, normalmente montamos 8 reações de 50 μL. As reações são reunidas (pool) para o próximo passo. Em geral, algumas reações de grande volume ou várias reações pequenas (como as reações de 50 μL que usamos) são suficientes para gerar quantidade adequada de modelo para várias reações de síntese de sonda.
    3. Para remover proteínas contaminantes, especialmente traços de RNase em preparações de plasmídeo, digira cada 100 μL da reação de PCR com 1 μL de Proteinase K a 20 mg/mL a 55 °C por pelo menos 30 minutos. Todos os reagentes e outros materiais usados após essa digestão com Proteinase K devem ser livres de RNase e especificamente dedicados ao trabalho com RNA.
    4. Durante a digestão com Proteinase K, analise uma amostra da reação de PCR em gel para verificar a integridade do produto de PCR. Usamos géis mini de acrilamida para resolver produtos de PCR menores (menos de 600-700 pb) e géis de agarose para resolver produtos de PCR maiores (>600-700 pb) na análise de controle de qualidade. Se observar múltiplas bandas no gel, recomendamos otimizar a reação de PCR para obter um único produto de PCR do tamanho correto.
    5. Extraia completamente a reação de PCR digerida com Proteinase K com um volume igual de uma mistura fenol/clorofórmio (1:1), seguido por uma extração com um volume igual de clorofórmio. Agite em cada etapa por meio de vortex por pelo menos 30 segundos. Esses passos devem ser realizados em capela de exaustão química.
    6. Precipite o produto de PCR purificado adicionando 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2 volumes de etanol 100%. Deixe a -20 °C por pelo menos 30 minutos.
    7. Centrifugue por 5 minutos a 13.000 rpm em uma microcentrífuga, remova o sobrenadante e lave com etanol 70%. Deixe o pellet de DNA secar completamente.
    8. Resuspenda o DNA em um volume adequado (por exemplo, 50 μL) de tampão 1xTE. Meça a concentração de DNA usando um fluorímetro.
    9. Determine a sequência de nucleotídeos de cada preparação do modelo de PCR usando iniciadores correspondentes às sequências promotoras do fago ou a uma sequência interna dentro da sonda. Este é um passo crítico de controle de qualidade que garante que o modelo da sonda tenha a sequência correta.
    10. O DNA está pronto para servir como modelo para transcrição in vitro. Armazene o modelo de DNA a 4 °C.
  2. Transcrição in vitro usando o produto de PCR como modelo.
    1. Monte uma reação de transcrição de RNA em volume final de 50 μL. A reação de transcrição inclui 500 - 1000 ng de DNA modelo, 5 μL de Tampão 10X de Transcrição (com DTT 100 mM), 10 μL de mistura 2,5 mM de dig-NTP, 3 μL (50˜90 unidades) de RNA polimerase, 1 μL de CTP-α-32P (com até 6 meses de idade) e complete o volume com água tratada com pirocarbonato de dietila. A mistura 2,5 mM de dig-NTP é normalmente preparada como um estoque de trabalho de 40 μL contendo 10 μL de CTP 10 mM, 10 μL de GTP 10 mM, 10 μL de ATP 10 mM, 6,5 μL de UTP 10 mM e 3,5 μL de digoxigenina-11-UTP 10 mM. Ao montar a reação de transcrição, certifique-se de que todos os componentes da reação (exceto a enzima) estejam aquecidos à temperatura ambiente. Primeiro misture o DNA e a água, depois adicione o tampão de reação, misture e então adicione os demais componentes, pois a espermidina presente no tampão de transcrição pode precipitar o DNA. Incube por 2 horas à temperatura recomendada para a RNA polimerase utilizada.
      Observação: o α-32P é adicionado à reação para permitir determinar a proporção da piscina inicial de nucleotídeos que é incorporada na sonda de RNA. Esta é uma medida importante da eficiência da reação. Todos os passos seguintes seguem os procedimentos para manipulação de 32P.
      Um método alternativo para medir a quantidade de sonda de RNA sintetizada é usar um espectrofotômetro de pequeno volume. Isso evita o uso de marcação com 32P (ver observações no passo 1.3.1)
    2. Nos últimos minutos de incubação, prepare a coluna Quick Spin (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Após a incubação, adicione 1 μL de DNase I livre de RNase e incube a 37 °C por 10 minutos.
    4. Dilua para 100 μL com 50 μL de tampão de diluição da reação (20 mM Tris pH 7,5, 1% SDS, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl (livre de RNase, prepare um estoque de 50 mL e armazene à temperatura ambiente)). Retire 1 μL (normalmente em 4 μL de tampão 1xTE) para contagem por cintilação dos contagens totais iniciais e para análise em gel.
    5. Aplicar o restante da reação no centro da coluna e centrifugar a 1100 X g por 4 minutos em uma centrífuga clínica de bancada. Após a centrifugação, sua sonda de RNA estará no tubo de coleta.
    6. Adicione 2 volumes de etanol 100% à reação eluída. Misture bem e mantenha no gelo por 5 minutos (ou a -20 °C por 30 minutos).
    7. Centrifugue o tubo em microcentrífuga à velocidade máxima por 5 minutos para pelotizar a sonda de RNA.
    8. Remova completamente o sobrenadante com pipeta e deixe o pellet secar ao ar. Não deixe o pellet secar em excesso, pois será muito difícil dissolvê-lo.
    9. Dissolva a sonda de RNA com 50 μL - 100 μL de tampão 1xTE ou H2O DEPC. Retire uma amostra de 1 μL para determinar a porcentagem de incorporação e para análise em gel desnaturante de acrilamida. Ajuste a concentração da sonda para 100 ng/μL de acordo com o rendimento estimado.
    10. Sondas que passaram pelos três controles de qualidade podem ser armazenadas a -20 °C por 6 a 12 meses. Normalmente esgotamos o estoque de sonda dentro de 12 meses. É muito provável que as sondas possam ser armazenadas por períodos muito prolongados a -20 °C.
  3. Avaliação da qualidade da ribossonda – medição do rendimento da sonda.
    1. Para estimar o rendimento da sonda, divida as contagens recuperadas após a coluna rotativa pelas contagens na reação antes da coluna rotativa (medidas com as amostras coletadas no protocolo de síntese da sonda). Para esta reação, 100% de incorporação equivale a 33 μg. Uma reação bem-sucedida geralmente apresenta um rendimento de 15-50%. Sondas com incorporação inferior a 15% (<5 μg de rendimento) não devem ser usadas.
      Observação: Um método alternativo para medir o rendimento da sonda é usar um espectrofotômetro ou fluorímetro de pequeno volume para medir diretamente a quantidade de RNA presente após a cromatografia em coluna rotativa. Essa abordagem alternativa evita o uso de marcação com traço de 32P. Medimos a concentração da ribossonda usando um espectrofotômetro de microplacas BioTek Epoch. Uma comparação dos valores obtidos no espectrofotômetro com as estimativas da massa da ribossonda pela incorporação de 32P mostrou que os dois métodos fornecem resultados comparáveis usando uma amostra de volume semelhante (2 μL) da preparação final da sonda.
      Quase sempre, um rendimento muito baixo ou nulo é devido à contaminação por RNase proveniente da preparação de plasmídeo usada como modelo para a PCR. Certifique-se de tratar seu DNA plasmidial e produto de PCR com proteinase K conforme descrito no passo 1.1.3.
  4. Avaliação da qualidade da ribossonda – medição da atividade específica.
    1. Para medir o grau de incorporação de digoxigenina-UTP, realize um teste de hibridização em ponto. Este é um teste crucial de controle de qualidade.
      Ajuste a concentração da sonda para 100 ng/μL. Aplique 1 μL de diluições seriadas (10-2 a 10-5) da sonda em um filtro de nylon de 82 mm de diâmetro Hybond-N+ (GE Healthcare) ou equivalente. Inclua uma amostra de DNA não marcado como controle negativo. Cruziligue imediatamente o filtro úmido em um cruzilinkador de UV a 125 mJoules ou conforme as instruções do fabricante para o filtro de nylon utilizado.
      Todos os passos seguintes (1.4.2 - 1.4.6) são realizados em uma placa de Petri sobre uma plataforma oscilante à temperatura ambiente. Não é necessário se preocupar com RNase após aplicar as diluições da sonda no filtro.
    2. Bloqueie o filtro por 30 minutos à temperatura ambiente em 10 mL de reagente bloqueador 1% (Roche) em tampão 1X TN (tampão 10X TN = 1 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl).
    3. Lave 1 vez por 15 minutos em 10 mL de tampão 1X TN.
    4. Incube com fragmento Fab anti-digoxigenina na diluição de 1/5000 em tampão 1X TN por 30 minutos.
    5. Lave 2 vezes por 15 minutos em 10 mL de tampão 1X TN.
    6. A reação colorimétrica é realizada com o substrato BM purple (necessário cerca de 5 mL na placa). A coloração deve ser visível no ponto correspondente à diluição 10-4 em 30 minutos. Nesse momento, interrompa a reação colorimétrica lavando 2 vezes por 5 minutos cada com tampão 5X TE. Se o sinal não for visível no ponto correspondente à diluição 10-4, a sonda deve ser descartada.
      Observação: Em nossa experiência, atividade específica inadequada só é observada com sondas curtas. Aumentar o tamanho do modelo da sonda (até 1 kb), mantendo os demais critérios de projeto especificados neste protocolo, deve aumentar a atividade específica da sonda. Baixa atividade específica leva a níveis baixos ou indetectáveis de sinal.
  5. Teste a integridade da sonda por eletroforese em gel desnaturante de acrilamida a 5%.
    Este é outro ensaio importante de controle de qualidade. Este protocolo assume que a sonda foi marcada com 32P durante a reação de síntese (ver passo 1.2.1). Usamos géis desnaturantes de acrilamida para obter resolução muito alta, permitindo-nos detectar facilmente sondas degradadas ou incompletas. Normalmente, um minigel desnaturante de acrilamida a 5% (7,5 g de uréia, 1,9 mL de acrilamida 40%, 1,9 mL de bis-acrilamida 2% (ou use uma solução de acrilamida:bis-acrilamida 20:1), 1,5 mL de tampão gel 10X MOPS (0,2 M morpholinopropanesulfonic acid, pH 7,0, 50 mM acetato de sódio, 5 mM EDTA) e H2O até volume final de 15 mL) funciona muito bem para resolver sondas nas faixas de tamanho usadas neste protocolo.
    Observação: Como alternativa, géis pré-moldados TBE-uréia podem ser adquiridos de vários fornecedores. Siga as instruções do fabricante para uso de géis pré-moldados.
    1. Misture a amostra com volume igual de tampão de carregamento para gel (Ambion) e homogeneíze bem.
    2. Aqueça a 95 °C por 5 minutos para desnaturar qualquer estrutura secundária.
    3. Resfrie imediatamente em gelo antes de carregar no gel para evitar re-annealing.
    4. Execute as amostras antes e depois da coluna juntas a 200 V até que o corante azul alcance o final do gel. O gel é corrido em tampão gel 1X MOPS.
    5. Envolva o gel em filme plástico e exponha-o a filme de raios X ou tela de imagem de fósforo para detectar o RNA marcado com radiação. Se a marcação com 32P não for usada, você pode corar o gel com um corante fluorescente convencional para detectar o RNA.
    6. Uma síntese bem-sucedida de sonda resultará em sondas de RNA que migram como uma banda nítida muito próxima ao topo do gel.

2. Coleta e armazenamento de embriões de camundongo

  1. Os embriões de camundongo devem ser coletados em PBST gelado (PBS + 0,1% Tween 20, tratado com diethylpirocarbonato (DEPC)) e mantidos em gelo durante a dissecação.
  2. Os embriões são processados em frascos de vidro com tampa rosqueável de 4 ml. Vários embriões podem ser fixados em um único frasco. Até 10 a 15 embriões E9,5 ou 5 embriões E10,5 podem ser fixados em um único frasco. Devido ao aumento do tamanho do embrião, os embriões E11,5 devem ser hemissectados com lâmina de barbear antes da fixação, para facilitar o acesso da sonda durante a hibridização. Até 3 embriões E11,5 hemissectados podem ser colocados em um único frasco.
  3. Para maximizar a eficácia das etapas deste protocolo e reduzir danos aos embriões, a fixação dos embriões e todas as lavagens são realizadas em frascos de amostra com os volumes preenchidos até o nível inferior do gargalo do frasco, de modo que apenas uma pequena bolha de ar permaneça, salvo indicação em contrário. Em todas as etapas de lavagem, os frascos são colocados deitados de lado sobre uma plataforma oscilante.
  4. Fixar por 6 horas até a noite a 4 °C em mesa agitadora com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBST. Os frascos devem ser colocados horizontalmente e agitados em uma plataforma oscilante a 4 °C.
  5. Após a fixação, os embriões são lavados duas vezes por 5 minutos cada em PBST em gelo e, em seguida, desidratados progressivamente por meio de uma série metanol/PBST (25% metanol em PBST, 50% metanol em PBST e 75% metanol em PBST) até 100% metanol, substituindo as soluções no frasco com pipetas Pasteur de vidro. Os embriões podem ser armazenados a -20 °C em metanol a 100% por até 8 meses ou talvez mais tempo.

3. Hibridização da sonda marcada com digoxigenina a embriões inteiros de camundongo

  1. Fure os corações e cabeças de embriões E10.5 e mais velhos com uma lâmina de microdissecação enquanto os embriões ainda estiverem em metanol (se isso não foi feito durante a dissecação). Este passo simples permite que as soluções de lavagem entrem nas vesículas cerebrais e nas câmaras cardíacas, reduzindo significativamente a coloração de fundo.
  2. Reidrate os embriões com lavagens sucessivas em uma série metanol/PBST (75% metanol em PBST, 50% metanol em PBST e depois 25% metanol em PBST), por 5-10 minutos em cada concentração de metanol. Lave duas vezes por 5 minutos cada lavagem em PBST 100%.
  3. Incube em PBST:30% H2O2 na proporção 4:1 por 1 hora em gelo. Em seguida, lave com três trocas de PBST 1X, cada uma por 5 minutos.
  4. Remova a última lavagem com PBST e substitua por 1 ml de proteinase K a 10 μg/ml em PBST. Durante a digestão com proteinase K, coloque os tubos verticalmente em um suporte dentro de um banho-maria a 25°C.
    Observação: Soluções de proteinase K perdem atividade ao longo do tempo devido à autodigestão. Para garantir atividade máxima e consistente, a solução de proteinase K deve ser preparada fresca imediatamente antes de cada uso. Para cada uso, prepare uma pequena quantidade de estoque a 1 mg/ml e depois dilua. O tempo de incubação deve ser determinado para cada lote de pó de proteinase K e para cada idade embrionária. Por exemplo, para embriões E9.5, um bom tempo geralmente é de 10-15 minutos a 25°C, enquanto para E10.5 é geralmente de 20-30 minutos a 25°C. O tempo de incubação com proteinase K também deve ser medido com precisão durante os experimentos para permitir comparações válidas entre frascos e entre experimentos. A temperatura deve ser cuidadosamente mantida durante a digestão para aumentar a reprodutibilidade. Diferenças tão pequenas quanto 1°C podem alterar a quantidade de digestão entre experimentos. Recomenda-se fortemente que as digestões com proteinase K sejam realizadas em um incubador ou banho-maria para controle preciso de temperatura. Este passo é crítico para permitir que a sonda penetre no tecido, gerando assim um sinal forte. No entanto, a superdigestão danificará os embriões, que gradualmente se desintegrarão ao longo das etapas restantes.
  5. Interrompa a digestão com proteinase K lavando duas vezes por 5 minutos cada lavagem à temperatura ambiente com glicina recém-preparada a 2 mg/ml em PBST. Em seguida, lave duas vezes por 5 minutos cada em PBST.
  6. Fixe os embriões digeridos por 20 minutos à temperatura ambiente em PFA 4%/PBST, 0,2% glutaraldeído (Polysciences). Não subfixe nem sobrefixe. Lave três vezes por 5 minutos cada em PBST.
  7. Neste ponto, os embriões devem ser divididos em grupos para hibridização. Remova o PBST. Adicione 1 ml de tampão de hibridização (50% formamida ultrapura (Invitrogen), 5x SSC, pH 5, 1% SDS, heparina 50 μg/ml (Acros), RNA de Torula 50 μg/ml (Sigma)) pré-aquecido a 65°C (sem sonda). Deixe os embriões sedimentarem, depois remova todo o tampão de hibridização e substitua por 1 ml de tampão de hibridização fresco e pré-aquecido sem sonda.
  8. Pré-hibridize por 1 hora a 65°C em um banho-maria agitado ou em um forno sobre uma plataforma oscilante (por exemplo, o forno Boekle Shake 'n' Bake, veja Tabela 1). Se incubar os frascos em banho-maria, certifique-se de que a água alcance, mas não ultrapasse, o topo dos frascos. A temperatura de hibridização pode ser aumentada até 70°C. Temperaturas de hibridização acima de 65°C não afetam a intensidade do sinal ou o fundo com a maioria das sondas que testamos. Os embriões tornam-se translúcidos, pegajosos e frágeis em tampões com formamida (por exemplo, tampão de hibridização); manuseie-os com cuidado.
  9. Substitua o tampão de pré-hibridização por 0,4 ml de tampão de hibridização contendo sonda na concentração de 0,25-1 μg/ml. Use 0,5 μg/ml de sonda para embriões até aproximadamente E8,5. Para embriões mais velhos, as sondas devem ser tituladas de 1-0,1 μg/ml para determinar a concentração ideal para um bom sinal com baixo fundo (geralmente 0,25-0,5 μg/ml ou algo próximo). Observe que volumes maiores de hibridização podem ser necessários para embriões maiores. Hibridize durante a noite a 65°C.
  10. Se os embriões foram supertratados com proteinase K, eles parecerão extremamente transparentes. Também podem grudar nas paredes do frasco ou se desfazer. Embriões com essa aparência devem ser descartados neste ponto do protocolo. Processá-los adiante não resultará em dados interpretáveis.
  11. Substitua o tampão de hibridização por Solução I aquecida (50% formamida, 5x SSC pH 5, 1% SDS) a 70°C. Lave duas vezes por 30 minutos cada lavagem para embriões E8,5, três vezes por 30 minutos cada lavagem para E9,5 e mais velhos.
  12. Lave uma vez com Solução I pré-aquecida a 50%: Solução II a 50% (0,5 M NaCl, 10 mM Tris HCl pH 7,5, 0,1% Tween 20) a 70°C por 10 minutos.
  13. Lave três vezes por 5 minutos cada lavagem com Solução II à temperatura ambiente.
  14. Substitua o tampão por Solução II contendo RNase A a 100 μg/ml, RNase T1 a 100 unidades/ml. Incube em agitador no ambiente aquecido a 37°C duas vezes por 30 minutos cada lavagem. A lavagem com RNase é essencial para reduzir o fundo resultante de sondas hibridizadas não especificamente.
  15. Lave duas vezes por 30 minutos cada lavagem com Solução III (50% formamida, 2x SSC pH 5) a 65°C para E8,5, três vezes por 30 minutos cada lavagem para E9,5 e mais velhos.
  16. Lave três vezes por 5 minutos cada lavagem com TBST 1X (100 ml de TBS 10X contém 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 12,5 ml de Tris HCl 2 M pH 7,6 em água. Para preparar TBST 1X, dilua o TBS 10X em volume apropriado de água e adicione Tween 20 até concentração final de 0,1%)
  17. A menos que especificado, todas as lavagens são realizadas nos frascos das amostras com as soluções preenchidas até o nível inferior do gargalo do frasco. Em todos os passos de lavagem, os frascos são colocados de lado sobre uma plataforma oscilante.

4. Detecção do anticorpo da sonda marcada com digoxigenina

  1. Os embriões são pré-bloqueados em 0,5 ml de TBST 1X + 10% de soro de ovelha tratado pelo calor. Em seguida, agite os tubos verticalmente à temperatura ambiente (˜ 20°C) por pelo menos 2,5 horas.
  2. Substitua a solução de bloqueio por TBST 1X fresco + 10% de soro contendo uma diluição de 1:2000 a 1:5000 de fragmentos Fab de anticorpo de ovelha anti-digoxigenina conjugados à fosfatase alcalina (subtraídos mediante incubação com pó de acetona de embrião, veja abaixo). Use diluições mais altas para embriões E9,5 e mais velhos, até 1:5000, para minimizar o fundo. Incube verticalmente em agitador a 4°C durante a noite.
    Observação: Descobrimos que a incubação dos fragmentos Fab anti-digoxigenina com pó de acetona de embrião reduz os níveis de coloração de fundo neste protocolo. Para preparar o pó de acetona de embrião, homogeneíze embriões de camundongo agrupados de E12,5 a E14,5 em um volume mínimo de PBS. Adicione 4 volumes de acetona gelada, misture e incube no gelo por 30 minutos. Remova o sobrenadante centrifugando a 10.000xg por 10 minutos. Lave o pellet com acetona gelada e centrifugue novamente. Espalhe o pellet e triture em pó sobre uma folha de papel filtro, deixando secar ao ar. O pó pode então ser armazenado em um tubo hermético a 4°C por anos.
    Para a subtração do anticorpo, o anticorpo deve ser pré-absorvido ao pó de acetona de embrião para reduzir a ligação inespecífica durante ou antes do pré-bloqueio. Incube o anticorpo em uma proporção de 1/100 com uma pequena quantidade de pó de embrião (a quantidade não é crítica) em TBST 1X/10% de soro por pelo menos 1 hora a 4°C com agitação. Remova o pó centrifugando em uma microcentrífuga por 10 minutos a 4°C. O anticorpo subtraído pode ser armazenado a 4°C por pelo menos 6 meses.
  3. Lave três vezes, por 5 minutos cada, com TBST 1X, depois 5 a 6 vezes por 1 hora cada, à temperatura ambiente, para remover o anticorpo em excesso. Se preferir, realize uma lavagem prolongada durante a noite a 4°C para reduzir o fundo. A lavagem noturna pode reduzir drasticamente os níveis de fundo, aumentando assim a relação sinal-ruído.
  4. Lave duas vezes por 20 minutos cada com tampão de fosfatase alcalina recém-preparado (100 mM Tris, pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20. Adicione 0,5 mg/ml de levamisol, um inibidor endógeno de AP, para embriões E9,5 e mais velhos).
  5. Substitua a última lavagem pelo substrato BM Purple AP (Roche) pré-aquecido à temperatura ambiente.
  6. Permita que a reação de coloração ocorra à temperatura ambiente, observando periodicamente o sinal por meio de um microscópio estereoscópico. Para reações de coloração prolongadas (várias horas até a noite), os tubos devem ser protegidos da luz. O sinal para RNAs mensageiros abundantes deve ser visível dentro de 15 minutos. As reações devem ser interrompidas quando o sinal for satisfatório ou quando o fundo começar a ser um problema. Se a própria solução começar a escurecer, é possível prolongar a reação de coloração substituindo a solução de substrato.
  7. Interrompa a reação lavando duas vezes por 5 minutos cada com PBST 1X/5 mM EDTA.
  8. Transfira para paraformaldeído 4%/PBST para re-fixar, por várias horas até a noite. Alternativamente, os embriões podem ser armazenados em paraformaldeído 4%/PBST 1X por anos ou podem ser processados imediatamente para inclusão em parafina. Esta etapa final de fixação é crucial para a preservação de longo prazo do padrão de coloração.

5. Inclusão em parafina e corte de embriões corados

  1. Antes de fixar os embriões após a reação de coloração (passo 4.8), são tiradas imagens dos embriões corados em montagem inteira quando o nível de coloração atingir a intensidade desejada. Após documentar os padrões de expressão nos embriões inteiros, eles são incubados no substrato BM purple durante a noite até 24 horas à temperatura ambiente até que todo o embrião fique azul escuro. Este passo tem como objetivo garantir que a coloração fique suficientemente escura para ser visível nos cortes histológicos. Observe que a cor azul do embrião é devida à deposição de uma camada muito fina de pigmento em toda a superfície do embrião. Essa coloração de fundo não será detectável no tecido de interesse após o corte.
  2. Lave os embriões corados com PBS três vezes para remover os precipitados em excesso do substrato e fixe durante a noite em PFA 4% a 4°C.
  3. Lave com PBS três vezes e, em seguida, desidrate os embriões em metanol 100% (conforme descrito no passo 2.4).
  4. Substitua o metanol final por xilol. Lave no xilol de 2 a 3 vezes, por 2 minutos cada lavagem, até que os embriões fiquem transparentes. Não exagere nas lavagens com xilol, pois isso tornará o tecido muito frágil após a inclusão, dificultando a obtenção de cortes intactos. Monitore visualmente cada incubação em xilol para garantir que os embriões atinjam apenas o ponto de transparência e tenha muito cuidado para não prolongar a incubação além desse ponto.
  5. Transfira os embriões (E10.5 e mais velhos) para cassete Biopsy Sure-Tek (Fisherbrand) e incube todo o cassete em parafina (Fisherbrand) por 15˜30 min a 65°C. Substitua por parafina fresca por mais 15˜30 min e depois troque novamente. Embriões menores/troncos teciduais menores requerem tempos mais curtos de incubação em parafina. Embriões E9.5 podem ser colocados diretamente nos moldes de inclusão tecidual para todas as trocas de parafina. Nesses casos, é possível remover a parafina do molde em vez de transferir os embriões.
  6. Após três trocas de parafina, transfira os embriões para os moldes de inclusão tecidual (Polysciences) e inclua-os em parafina fresca. Posicione cuidadosamente os embriões no plano desejado para o corte. Deixe a parafina esfriar até solidificar completamente.
  7. Corte os blocos de parafina em fatias de 8˜14μm utilizando um micrótomo padrão (por exemplo, Leica RM2155). Colete os cortes em lâminas de microscópio (Fisherbrand).
  8. Deixe as lâminas secarem em posição horizontal sobre um aquecedor de lâminas. As lâminas podem ser armazenadas a 4°C por meses.
  9. Os cortes secos são desparafinizados com duas lavagens de 5 min em xilol e reidratados em água por lavagens seriadas em metanol/água (metanol 100% por 2 min, metanol 100% por 2 min, metanol/água 90% por 2 min, metanol/água 70% por 2 min, água desionizada por 5 min).
  10. Coloque os cortes em solução de corante vermelho rápido nuclear (Sigma) por 1 minuto. Para preparar a solução de vermelho rápido nuclear, dilua um estoque concentrado de vermelho rápido nuclear (0,1% de vermelho rápido nuclear em 5% de sulfato de alumínio em água, dissolva com aquecimento e filtre em papel filtro Whatman) na proporção de 1:5 em uma solução aquosa de 5% de sulfato de alumínio. Após a coloração, lave as lâminas com água corrente até que a água fique límpida. O vermelho rápido nuclear atua como contra-coloração e revela a estrutura geral do tecido nos cortes. Sua cor contrasta bem com a coloração roxa-azulada que marca a localização da sonda de RNA. O vermelho rápido nuclear é um corante de saturação e a intensidade da coloração é controlada pela concentração da solução. Se a intensidade da coloração com vermelho rápido nuclear for inadequada ao usar esta solução, repita este passo com uma solução mais concentrada de vermelho rápido nuclear.
  11. Prepare as lâminas para a montagem de lamínulas com lavagens em cada uma das soluções da seguinte série: metanol/água 90%, seguido por duas lavagens em metanol 100%, seguidas por duas lavagens em xilol. Incube a lâmina por 2 minutos em cada lavagem.
  12. Monte as lâminas com meio de montagem Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific). Observe que meios de montagem aquosos dissolverão a coloração com vermelho rápido nuclear.
    Observação: também utilizamos uma resina plástica para inclusão (Immuno-Bed, Polysciences Inc) para gerar cortes de embriões corados com excelentes resultados 4.

6. Resultados Representativos:

A Figura 1 ilustra resultados representativos obtidos usando este protocolo. A Figura 1A mostra o padrão de expressão de Gata3 em embriões de camundongo E10.5. Este painel ilustra um bom resultado com uma alta relação sinal/fundo. A Figura 1C, em contraste, mostra uma hibridização in situ fracassada para o mRNA de Gata3 que utilizou uma sonda de RNA parcialmente degradada. Uma sonda com baixa atividade específica resultará em resultados semelhantes, com baixo contraste entre sinal e fundo. Uma comparação entre os painéis A e C ilustra a importância de realizar avaliações cuidadosas de controle de qualidade da sonda para garantir resultados de alta qualidade. O resultado obtido com a sonda Foxg1 (Figura 1B) também ilustra um bom resultado, com coloração específica no telencéfalo e fundo baixo em outras partes do cérebro. O cérebro e o coração são locais comuns de coloração de fundo causada pelo aprisionamento da sonda. Perfurar o cérebro e o coração com pinça permite que as soluções de lavagem penetrem no embrião e minimiza a coloração de fundo (ver etapa 3.1). A Figura 1D ilustra o fundo azul claro típico encontrado quando o cérebro não é perfurado. Isso mostra um resultado subótimo obtido usando uma sonda Pax1. Pax1 não é expresso em nenhuma parte do cérebro, e toda a coloração observada no cérebro deste embrião é devida ao fundo não específico.

Expressão gênica no embrião: diagramas mostrando coloração de Gata3, Foxg1 e Pax1 em estágios de desenvolvimento.
Figura 1. Resultados representativos mostrando exemplos de resultados bem-sucedidos (A, B) e subótimos (C, D). A. Embrião E10,5 hibridizado com sonda Gata3. B. Embrião E11,5 hibridizado com sonda Foxg1. C. Embrião E10,5 hibridizado com sonda Gata3 parcialmente degradada, mostrando sinal muito fraco, mas fundo elevado em todo o embrião. D. Embrião E10,5 hibridizado com sonda Pax1 sem perfuração da cabeça, mostrando coloração de fundo nos ventrículos (cabeças de seta).

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Discussão

Os métodos descritos neste protocolo foram adaptados de diversas fontes e otimizados para embriões de camundongo inteiros com idade entre E8,5 e E11,5. Os métodos para hibridização in situ em preparações inteiras de embriões de vertebrados surgiram pela primeira vez no início da década de 1990 2,5-12. Este protocolo foi adaptado principalmente a partir de métodos desenvolvidos para embriões de Xenopus 7,8, bem como para camundongos 2,11. Em nosso protocolo, grande ênfase é dada à...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH R21MH082360 (BGC) e R01HD056315 (NRM), bem como pela University of Georgia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Trifosfato de digoxigenina-11-uridina-5’ReagenteRoche Group11209256910
Conjunto de trifosfatos de ribonucleosídeosReagenteRoche Group11277057001
Colunas Quick Spin para purificação de RNA radiomarcadoInsumoRoche Group11274015001
Polimerase de RNA T7ReagenteRoche Group10881767001
Polimerase de RNA SP6ReagenteRoche Group10810274001
Polimerase de RNA T3ReagenteRoche Group11031163001
CTP, [α-32P] - 800 Ci/mmol, 10 mCi/mL, 250 μCiReagentePerkinElmer, Inc.BLU008X250UC
DNase I recombinante, livre de RNaseReagenteRoche Group4716728001
Uréia, cristais incolores a brancos ou pó cristalinoReagenteFisher ScientificBP169-500
Tampão de carregamento para gelReagenteAmbionAM8547
Hybond-N+, AmershamInsumoGE HealthcareRPN82B
UV Stratalinker 2400EquipamentoStratagene, Agilent Technologies
Pirocarbonato de dietilaReagenteSigma-AldrichD5758-100ML
Heparina sódicaReagenteAcros Organics41121-0010
Peróxido de hidrogênio a 30% em águaReagenteFisher ScientificBP2633-500
Glutaraldeído, grau EM, 8%ReagentePolysciences, Inc.0/710Usar com cautela conforme as instruções do fabricante’
Reagente bloqueadorReagenteRoche Group11096176001Preparar solução estoque a 5% e armazenar a -20°C
Protease KReagenteRoche Group3115852001
Rnase A ReagenteRoche Group10109142001Preparar solução estoque a 10 mg/mL e armazenar a -20°C.
Rnase T1ReagenteRoche Group10109193001
Formamida ultrapuraReagenteInvitrogen15515-026
Levamisol hidrocloretoReagenteICN Biomedicals155228
Ácido ribonucleico de levedura torula, Tipo VIReagenteSigma-AldrichR6625extraído várias vezes com fenol/clorofórmio e precipitado, ressuspenso em H2O tratada com DEPC e armazenado a -20°C
Fragments Fab anti-digoxigenina-APReagenteRoche Group11093274910
Substrato BM Purple AP, precipitante. Solução pronta para uso.ReagenteRoche Group11 442 074 001
Kit de conveniência para frascos de armazenamento, 4 mL, transparentes, com tampa fechadaInsumoNational Scientific CompanyB7800-2
Forno de hibridização Shake N BakeEquipamentoBoekel Scientific136400
Biopsy Sure-TekInsumo Fisher Scientific15-200-402C
Meio de inclusão de tecidos Paraplast PlusReagenteFisher Scientific23-021-400
Moldes plásticos descartáveis Peel-A-Way para inclusão de tecidosInsumoPolysciences, Inc.18646A
Lâminas microscópicas Colorfrost PlusInsumoFisher Scientific12-550-17
Vermelho Nuclear RápidoReagenteSigma-AldrichN8002
Cytoseal 60ReagenteRichard-Allan Scientific8310-16

Referências

  1. Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
  2. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  3. Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
  4. Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
  5. Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
  6. Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
  7. Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
  8. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  9. Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
  10. Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
  11. Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
  12. Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
  13. Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  14. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
  15. Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
  16. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).

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Reimpressões e permissões

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Expressão Gênica em Embriões de CamundongosSonda de RNA Marcada com DIGControle de Qualidade da SondaDigestão com Proteinase KCondições de HibridizaçãoDetecção por Fosfatase AlcalinaArmazenamento de Fixação de EmbriõesSubstrato BM PurpleLavagens de Tratamento com RNase
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