Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Resumo

Este protocolo de hibridização in situ em preparação inteira discute etapas críticas que garantem resultados de alta qualidade e reprodutíveis para estudos de expressão gênica em embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias.

Resumo

A hibridização in situ em preparação inteira é uma abordagem muito informativa para definir os padrões de expressão gênica em embriões. Os procedimentos de hibridização in situ são demorados e tecnicamente exigentes, com múltiplas etapas importantes que conjuntamente contribuem para a qualidade do resultado final. Este protocolo descreve em detalhes várias etapas-chave de controle de qualidade para otimizar a marcação e o desempenho da sonda. De modo geral, nosso protocolo fornece uma descrição detalhada das etapas críticas necessárias para obter resultados de alta qualidade de forma reprodutível. Primeiramente, descrevemos a geração de sondas de RNA marcadas com digoxigenina (DIG) por meio de transcrição in vitro de modelos de DNA gerados por PCR. Descrevemos três ensaios críticos de controle de qualidade para determinar a quantidade, a integridade e a atividade específica das sondas marcadas com DIG. Essas etapas são importantes para gerar uma sonda com sensibilidade suficiente para detectar RNAm endógenos em um embrião inteiro de camundongo. Além disso, descrevemos métodos para a fixação e o armazenamento de embriões de camundongo com idade entre E8,5 e E11,5 dias para hibridização in situ. Em seguida, descrevemos métodos detalhados para digestão limitada com proteinase K dos embriões reidratados, seguidos pelos detalhes das condições de hibridização, lavagens pós-hibridização e tratamento com RNase para remover a hibridização não específica da sonda. Um anticorpo conjugado à fosfatase alcalina (AP) é utilizado para visualizar a sonda marcada e revelar o padrão de expressão do transcrito endógeno. Resultados representativos são apresentados a partir de experimentos bem-sucedidos e de experimentos típicos subótimos.

Protocolo

1. Geração de riboprobes por transcrição in vitro

1. Preparação de produtos de PCR para uso como modelos de transcrição in vitro.
   1. Projete os iniciadores de PCR com sequências promotoras de transcrição de fagos nas extremidades 5'.
      Observação: A sequência promotora adicionada à extremidade 5' do iniciador de PCR da fita sentido será usada para transcrever a sonda sentido, e a sequência promotora adicionada à extremidade 5' do iniciador de PCR da fita antissenso será usada para sintetizar a sonda antissenso^1-3. Não detectamos diferença na eficiência de transcrição entre modelos que contêm apenas a....

Discussão

Os métodos descritos neste protocolo foram adaptados de diversas fontes e otimizados para embriões de camundongo inteiros com idade entre E8,5 e E11,5. Os métodos para hibridização in situ em preparações inteiras de embriões de vertebrados surgiram pela primeira vez no início da década de 1990 ^2,5-12. Este protocolo foi adaptado principalmente a partir de métodos desenvolvidos para embriões de Xenopus ^7,8, bem como para camundongos ^2,11. Em nosso protocolo, grande ênfase é dada à.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Trifosfato de digoxigenina-11-uridina-5’	Reagente	Roche Group	11209256910
Conjunto de trifosfatos de ribonucleosídeos	Reagente	Roche Group	11277057001
Colunas Quick Spin para purificação de RNA radiomarcado	Insumo	Roche Group	11274015001
Polimerase de RNA T7	Reagente	Roche Group	10881767001
Polimerase de RNA SP6	Reagente	Roche Group	10810274001
Polimerase de RNA T3	Reagente	Roche Group	11031163001
CTP, [α-32P] - 800 Ci/mmol, 10 mCi/mL, 250 μCi	Reagente	PerkinElmer, Inc.	BLU008X250UC
DNase I recombinante, livre de RNase	Reagente	Roche Group	4716728001
Uréia, cristais incolores a brancos ou pó cristalino	Reagente	Fisher Scientific	BP169-500
Tampão de carregamento para gel	Reagente	Ambion	AM8547
Hybond-N+, Amersham	Insumo	GE Healthcare	RPN82B
UV Stratalinker 2400	Equipamento	Stratagene, Agilent Technologies
Pirocarbonato de dietila	Reagente	Sigma-Aldrich	D5758-100ML
Heparina sódica	Reagente	Acros Organics	41121-0010
Peróxido de hidrogênio a 30% em água	Reagente	Fisher Scientific	BP2633-500
Glutaraldeído, grau EM, 8%	Reagente	Polysciences, Inc.	0/710	Usar com cautela conforme as instruções do fabricante’
Reagente bloqueador	Reagente	Roche Group	11096176001	Preparar solução estoque a 5% e armazenar a -20°C
Protease K	Reagente	Roche Group	3115852001
Rnase A	Reagente	Roche Group	10109142001	Preparar solução estoque a 10 mg/mL e armazenar a -20°C.
Rnase T1	Reagente	Roche Group	10109193001
Formamida ultrapura	Reagente	Invitrogen	15515-026
Levamisol hidrocloreto	Reagente	ICN Biomedicals	155228
Ácido ribonucleico de levedura torula, Tipo VI	Reagente	Sigma-Aldrich	R6625	extraído várias vezes com fenol/clorofórmio e precipitado, ressuspenso em H2O tratada com DEPC e armazenado a -20°C
Fragments Fab anti-digoxigenina-AP	Reagente	Roche Group	11093274910
Substrato BM Purple AP, precipitante. Solução pronta para uso.	Reagente	Roche Group	11 442 074 001
Kit de conveniência para frascos de armazenamento, 4 mL, transparentes, com tampa fechada	Insumo	National Scientific Company	B7800-2
Forno de hibridização Shake N Bake	Equipamento	Boekel Scientific	136400
Biopsy Sure-Tek	Insumo	Fisher Scientific	15-200-402C
Meio de inclusão de tecidos Paraplast Plus	Reagente	Fisher Scientific	23-021-400
Moldes plásticos descartáveis Peel-A-Way para inclusão de tecidos	Insumo	Polysciences, Inc.	18646A
Lâminas microscópicas Colorfrost Plus	Insumo	Fisher Scientific	12-550-17
Vermelho Nuclear Rápido	Reagente	Sigma-Aldrich	N8002
Cytoseal 60	Reagente	Richard-Allan Scientific	8310-16