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1. Inoculação do tumor em CAM embrião aviária
- Prepare shell-less embriões de galinha fertilizados, conforme descrito 8.
- No dia 9 do desenvolvimento embrionário, montar uma micro-injector utilizando uma agulha de calibre 18 conectada em uma seringa mL. Corte um pedaço 5-6 polegadas de tubo Tygon (1 / 32 "de diâmetro interior, 3 / 32" de diâmetro externo, 1 / 32 "a espessura da parede) e insira cuidadosamente bisel da agulha na tubulação. Aproximadamente 4-5 polegadas da tubulação deve estendem desde a ponta da agulha (Figura 1a).
- Encha a seringa e tubo com suspensão de células. Em seguida, insira uma agulha de vidro microinjeção no final da tubulação e remova cuidadosamente as bolhas de ar.
- Injetar Dia 9 embriões (Figura 1b), sob um escopo dissecção com um iluminador com 10.000-100.000 células do câncer como um bolo dentro do CAM (Figura 1c). Lentamente injetar células e cuidadosamente garantir que a agulha está no lugar correto para as células para formar um bolo visível dentro da CAM. Células que por gotejamento sobre a superfície CAM podem ser limpos utilizando aplicador Kimwipe ou outros.
- Retorno embriões para incubadora umidificada a 38 ° C com umidade de 60% e permitir que o tumor cresça e irrigar (até 7 dias).
2. Preparação de nanopartículas
- Para preparar nanopartículas fluorescente etiquetado CPMV para injecção no embrião de galinha; diluir as nanopartículas viral (sintetizado como 8 em PBS, pH 7,4, a uma concentração de 100 mg / ml mistura Vortex bem antes de usar e centrifugar por um minuto para remover qualquer. agregados Sonication. também pode ser útil dependendo conjugados e grau de agregação. Stocks de CPMVs fluorescente etiquetado são estáveis por pelo menos 1 ano quando armazenado a 4 ° C no escuro. Verifique periodicamente ações, colocando algumas gotas numa lâmina de vidro e verificação de fluorescência. microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também pode ser usado para determinar se as partículas permaneceram intactas após conjugação.
- Resumidamente, um micrograma de nanopartículas viral (em um volume final de 2 mL) podem ser adicionados às redes de cobre revestido. Em seguida, adicione um volume igual de acetato de uranila 2% durante 1 minuto, microscópio eletrônico (Philips EM 410).
3. Injeção intravenosa de fluorescência marcado com nanopartículas viral
- No dia 16, montar micro-injector, como descrito acima. Elaborar volume desejado de nanopartículas viral através do tubo para dentro da seringa (> mL 200). Remova cuidadosamente as bolhas de ar. Inserir a agulha de vidro microinjeção no final da tubulação. Assegurar que a agulha é tão longo e afilado possível (Figura 2a). Se a agulha estiver muito fechado, não será capaz de perfurar o ectoderma e deixará de penetrar no navio. Se a agulha estiver muito acentuado, a ponta entrará em colapso ao penetrar tecidos.
- Por via intravenosa injetar 100 ml de 1 mg / ml de fluoresceína dextran (70.000 MW Da, Invitrogen) em embrião tendo tumor distal do site desejado a ser visualizado (Figura 3d). Canulação da veia CAM sucesso é evidente pela clearing de sangue no caminho do fluxo da injeção (Figura 2b). Avaliar vascular 1 hora após a injeção de vazamento.
- Por via intravenosa injetar 50 ul de 1 mg / ml de solução de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) ou peguilado CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) em embriões com tumores com vazamento vascular distal do site desejado ser visualizados.
- Tumores imagem imediatamente ea cada hora após a injeção usando uma Zeiss Examiner Z1 microscópio vertical equipado com um disco giratório Yokogawa, Hamamatsu Imagem 9100-12 câmera EM-CCD.
4. Em tempo real de imagens intravital
- Para montar a unidade de imagem do embrião, aplique uma fina camada de graxa de vácuo em torno da circunferência do porto de imagem na parte inferior da tampa da unidade de imagem do embrião, e se encaixam uma lamela de vidro 18 milímetros para o porto.
- Posição do embrião de tal forma que a lamela vai cobrir a área desejada para a imagem latente. Lentamente abaixe a tampa até que a lamínula só faz contato com o embrião, e então parafuso a tampa sobre a unidade para segurá-la no lugar (Figura 2c).
- Adicione a água aquecida a 37 ° C para a unidade de imagem do embrião fora do prato contendo o embrião, e em seguida, coloque a unidade inteira para o palco de um microscópio confocal na vertical com o interior da câmara ambiental equilibrado a 37 ° C.
- Unidade de posição da imagem contendo o embrião sob o Spinning microscópio de fluorescência confocal de disco (Figura 2e). A unidade de imagem irá realizar o embrião no lugar e manter o campo de visão, enquanto a captura de imagens fixas, permitindo a ambas as pilhas tridimensionais Z e lapso de tempo que as imagens sejam capturadas. Nós adquirir e analisar tridimensional lapso de tempo imagens usando Perkin Elmer (anteriormente Improvisation) Pacote de software Volocity (Figura 3a). Adquirir uma alta resolução tridimensional pilha do tumor e vascularização em torno de visualizar detailed análises estruturais específicas em tempo de pontos. Adquirir tridimensional pilhas em intervalos regulares de tempo, aponta para mapa detalhado mudanças estruturais na vasculatura tumoral. Tumores de imagem a cada hora após a injeção.
- Quantificar a absorção de nanopartículas viral através do cálculo da média Alexa Fluor (AF) 647 sinal dentro de regiões selecionadas no tumor ou no estroma software quantificação (não-tumorais área) usando a imagem como Volocity (Perkin Elmer). O tumor de estroma proporção foi calculada dividindo a média AF 647 sinal no tumor sobre a média AF 647 sinal no estroma. A relação tumor / estroma maior que 1 indica que as nanopartículas está sendo tomada pelo tumor.
5. Resultados representativos:
No exemplo aqui descrito, injetamos HT-29 células de câncer de cólon para formar um bolo de aproximadamente 1 milímetro de tamanho dentro da CAM de embriões dia 9 de frango (Figura 1b). Após a inoculação, os embriões foram cultivados por 7 dias em uma incubadora umidificada para permitir o crescimento do tumor suficiente e vascularização (Figura 1c). Embriões foram injetados por via intravenosa com um baixo peso molecular dextran para confirmar a vascularização do tumor, e os tumores foram visualizadas ao microscópio Zeiss Z1 AxioExaminer vertical (Figura 2d).
Após a administração intravenosa de CPMV AF-647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanopartículas (Figura 3a e b), de alta resolução em tempo real confocal de imagem (Figura 2e) revelou que tanto CPMV e CPMV-PEG nanopartículas rapidamente rotulados toda a vasculatura, mas a captação de CPMV-PEG pelo tumor foi de aproximadamente 3 vezes superior CPMV após 12 horas (Figura 3). A captação tumoral relativa de nanopartículas foi determinada utilizando software de análise de imagem (Volocity da Perkin Elmer). Regiões de interesse foram selecionados dentro e fora do tumor (no compartimento estromal) ea intensidade média de fluorescência de cada um era determinado. Os dados são expressos como tumor / estroma ratio.
Figura 1. Microinjeção de tumores no CAM de um embrião aviária. (A) O aparelho microinjeção é montado a partir dos componentes, como indicado. (B) os embriões das aves no dia 9 está pronto para ser inoculado com tumor quando o CAM tem se espalhado para cobrir toda a superfície. (C) No dia 16, o tumor terá crescido a até 1 cm de diâmetro (linha pontilhada) e está pronto para a injecção com nanopartículas.
Figura 2. Injeção de nanopartículas e imagem intravital. Injeção sob um microscópio de dissecação mostrando (a) a ponta da agulha microinjetor pronto para ser injetado na veia CAM e (b) a agulha microinjetor introduzida na veia (indicado pela seta) e nanopartículas injetadas no fluxo de sangue (visto limpando de sangue). (C) da unidade de imagem contendo embrião aviária com a lamela interface diretamente com o CAM. (D) Antes da injeção de nanopartículas, vascularização do tumor é avaliada através de imagens intravital após a injeção de fluoresceína dextran. (E) da unidade de imagem contendo o embrião posicionado no palco de um microscópio confocal na vertical dentro de uma temperatura regulada a clausura a 37 ° C.
Figura 3. Visualização intravital da captação de nanopartículas em tumores humanos. Tumores são visualizados sete horas após a injeção de (a) CPMV-AF647 e (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excisão de tumor de embrião de aves para análise posterior.