Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.
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Artigo de método
Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aves selvagens têm sido implicados na disseminação da Gripe aviária altamente patogénica (GAAP) do subtipo H5N1, o que levou a vigilância ao longo de rotas migratórias. Amostragem de aves selvagens para o vírus da gripe aviária (AIV) é muitas vezes realizado em regiões remotas, mas os resultados são muitas vezes adiada devido à necessidade de transportar amostras para um laboratório equipado para o teste molecular. Em tempo real da transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase (PCR rRT-) é uma técnica molecular que oferece um dos métodos mais precisos e sensíveis para o diagnóstico de AIV. Os protocolos de laboratório anteriormente estritamente necessário para rRT-PCR estão sendo adaptados para o campo. Desenvolvimento de reagentes liofilizados (liofilizado) que não exigem cadeia de frio, com sensibilidade ao nível dos reagentes molhada trouxe o teste no local remoto a um objetivo prático.
Aqui apresentamos um método para o diagnóstico rápido de AIV em aves selvagens usando uma unidade rRT-PCR (Dispositivo de Identificação Ruggedized avançada de patógenos ou RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), que emprega reagentes liofilizados (Influenza A Meta 1 Taqman; Asay ASY-0109-, Idaho Technologies). Os reagentes contêm todos os componentes necessários para o teste em concentrações adequadas, em um único tubo: primers, sondas, enzimas, amortecedores e controles positivos internos, eliminando erros associados com o armazenamento inadequado ou manuseio de reagentes molhado. A unidade portátil executa uma tela para Influenza A, visando o gene matriz e produz resultados em 2-3 horas. Subtipagem genética também é possível com primer H5 e H7 conjuntos que visam o gene hemaglutinina.
O sistema é adequado para uso coletadas de aves selvagens, como demonstrado aqui sobre as espécies migratórias shorebird, o maçarico ocidental (Calidrus mauri) capturado no norte da Califórnia. Em amostras de cloaca e orofaringe Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. A principal vantagem desta técnica é para agilizar o diagnóstico das aves selvagens, aumentando as chances de conter um surto em um local remoto. No local, o diagnóstico também ser útil para identificar e estudar os indivíduos infectados em populações selvagens. A oportunidade para coletar informações sobre a biologia do hospedeiro (resposta imunológica à infecção e fisiológicas) e ecologia espacial (performance migratória de aves infectadas) fornecerá insights sobre a medida em que as aves selvagens podem atuar como vetores para AIV a longas distâncias.
Protocolo
1. Captura de aves selvagens usando redes de neblina
- Para a captura de shorebird, configurar redes de neblina em um sítio ativo de forrageamento como um pântano, costa, ou lama plana.
- Deslize linha de tresmalho loops de uma extremidade da rede de neblina em torno do pólo e inserir pole verticalmente em lama.
- Estende a net, insira segundo pólo através de loops de tresmalho na outra extremidade da rede de neblina e verticalmente inserir pole em lama, certificando-se que as linhas de tresmalho são ensinados.
- Uma vez que um pássaro é capturado, extrair o pássaro da rede e voltar para a estação de bandas.
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Discussão
O método de diagnóstico rápido aqui apresentados facilita os testes de tempo eficiente e preciso de amostras de aves selvagens para a vigilância de AIV. Os requisitos espécime muito menos rigorosas de armazenamento portátil de rRT-PCR são adequadas para situações remotas, onde a manutenção de uma cadeia de frio pode ser impraticável se carregadores de nitrogênio líquido ou gelo seco não está disponível. Além disso, descobrimos que a análise da amostra com os reagentes liofilizados foi suficientemente simples para ser re.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Queremos agradecer Scullion M. e R. Crisp de Idaho Technologies para o suporte técnico eo USGS ocidental Centro de Pesquisa Ecológica de financiamento (S. Schwarzbach) e assistência (K. Spragens, T. Graham). Esta pesquisa foi realizada sob os auspícios do Centro para Inovação Tecnológica - Instituto de Defesa e Segurança Interna (www.idhs.org), em apoio ao Departamento de Defesa e Laboratório de Pesquisas da Força Aérea. Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. Qualquer uso do comércio, produto ou empres....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número Catálogo | Comentários (opcional) |
| Coluna de spin RNeasy mini- | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| Tubos de coleta (1,5 e 2 mL) | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| Tampão RLT | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| Tampão RW1 | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| Tampão RPE | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| RNase água | Qiagen | 74106 | Incluído no Kit Mini RNeasy |
| 14,3 M de solução de β-mercaptoetanol | Fisher Scientific | BP176100 | |
| Etanol 100% | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Meta 1 (Probe Hidrólise) | Idaho Technologies | Asay-ASY-0109 | |
| LightCycler 20ml tubos capilares | Roche Applied Science | 04929292001 | |
| Micro-centrífuga com rotor para tubos de 2 mL | Idaho Technologies | Incluído no kit RAPID | |
| Dispositivo de Identificação Ruggedized avançada de patógenos (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Incluído no kit RAPID | |
| Pentium laptop com Windows XP Professional | Idaho Technologies | Incluído no kit RAPID | |
| LightCycler software de Análise de Dados | Idaho Technologies | Incluído no kit RAPID |
Referências
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y.
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Reimpressões e permissões
