Summary
维护，检测和序列禽流感病毒的RNA的方法进行了验证和扩展，从鸟类的自然粪便样本。这种技术消除了保持冷静的链和处理传染性病毒的必要性和可应用在一个96孔高通量设置。
Abstract
感染禽流感病毒（AIVs）的许多哺乳动物，包括人类在内的 1 。这些AIVs是多种多样的，在其自然宿主，窝藏几乎所有可能的病毒亚型。人类的流感大流行最初来源于AIVs 3。许多致命的H5N1疫情在近年的人类感染病例的报道。最近，一个新的禽流感病毒相关的应变席卷整个人类的人口，造成“猪流感疫情”4 。虽然人类的贸易和运输活动，似乎是负责的高致病性菌株 5的传播，扩散也可以部分归因于野生鸟类6， 7。然而，所有禽流感病毒株的实际水库的野生鸟类。
在反应和家禽业面临严重的商业损失，已实施了大型监视计划在全球范围内收集信息，对生态AIVs安装预警系统，以检测某些高致病性菌株8-12。传统的病毒学方法要求病毒和分析前是完好的耕地。深冷冻机和沉重的生物安全程序到位，在运输过程中必须严格的冷链。长期监测，因此通常仅限于几个场站，装备精良的实验室。偏远地区无法进行采样，除非实施后勤手续繁琐。这些问题已经被公认为13，14和使用替代的储存和运输策略调查（醇类或胍）15-17 。最近，克劳斯等 18介绍的方法收集，储存和运输的禽流感病毒样本，基于一个特殊的滤纸。 FTA卡19保存在干燥的存储基础20 RNA和渲染病原体接触后21日无效。这项研究表明，FTA卡可以用来检测禽流感病毒的RNA在反转录PCR，可能是导致基因测序，病毒的基因，并确定。
在克劳斯等人 18的研究在实验室分离出禽流感病毒，并单独处理样品。在这里介绍的扩展，从Ottenby鸟天文台（SE瑞典）鸭陷阱野生鸟类的粪便样本进行了测试，直接说明了野战条件下的方法的实用性。捉鸭和泄殖腔拭子样品的采集是证明。目前的协议，包括从单管处理96井设计的工作流程缩放。虽然比传统方法敏感，FTA卡的方法提供了一个优良的大型监控计划的补充。它可以在世界任何地方的样本收集和分析，而不需要保持阴凉链或有害试剂，如酒精或胍，航运方面的安全法规。
Protocol
1。鸭捕获和泄殖腔抽汲
- 他们通过吸引与诱惑鸭或食品陷阱涉足鸭属阿纳斯 （或其他鸟类）在一个笼子里，并放入个人卡板箱。运输包装盒中的时间应保持在最低限度，例如，通过安装在短距离内的陷阱一个场站。在每个研究物流的情况下可能会有所不同。要求，需要为每个新设置的意见和相关的动物伦理委员会的批准。另外，还猎人拍摄鸟类进行采样。
- 它的翅膀紧紧地抱着它的身体，以鸭出的方块。品尝新鲜的下降，这将是目前在大多数情况下，直接从盒子的底部。它们捡起来，用无菌棉签和应用流体用Whatman FTA卡。如果没有，进行泄殖腔擦拭。
- 在它的后面打开的鸭子。这允许访问泄殖腔和方便采样。泄殖腔位于腹部，靠近基地的尾巴下面是一个突出的结构。一个有经验的人可以在同一时间持有和样品的鸟，否则第二个人可以协助。
- 小心地插入无菌塑料粘胶棉签（Copan公司，意大利），约1厘米，使泄殖腔的温柔漩涡。卷棉签从泄殖腔在用Whatman FTA卡表面的流体。已进行取样后立即释放动物是可取的。
- 在室温下干燥至少1小时的FTA卡，然后分别存储每个样本的纸袋（如信封）。在室温下储存可能，可能与潮湿的气候中的硅珠。发送和接收机构的生物安全人员可以允许通过普通邮件发送FTA卡，因为病原体成为与FTA卡表面接触后无效。
2。病毒RNA提取
- 提取的FTA卡包括粪便/泄殖腔流体材料。打孔三个光碟与哈里斯2毫米打孔和地方所有成核糖核酸免费96well板块以及的。彼此之间新的样品，仔细清洁的打孔机，用酒精和一个金精密擦拭（Kimtech）。始终使用阳性和阴性对照。阳性对照，可以由新鲜适用的FTA卡的实验室应变，或一个自然的样本，这是了解产生积极的结果。作为阴性对照，一拳从一个空的自由贸易协定卡光盘。此外，留下另一位后来在实验中的PCR控制的自由（与水为模板）。
- 加入70μlRNA的快速提取液（Ambion公司）和热封板（AbGene热封口机）。与确定的速度不会导致溢出（这取决于所用的板振动筛模型;提前测试），在室温下孵育5分钟一盘振动筛。
- 根据制造商的协议MagMAX - 96病毒RNA提取试剂盒（Ambion公司），携带病毒RNA分离。简介：准备裂解/约束力的解决办法（套件），每孔加入130μl。转移50μL提取FTA卡材料，每口井。 1分钟摇板。
- 加入20μL准备珠混合（套件），每个样品和混合吹打向上和向下。确定速度摇动5分钟。 RNA分子结合的磁珠。
- 移动板磁性的96站捕捉到的珠。根据磁独立使用的模型，这可能需要超过5分钟。当溶液变成了彻底清除，删除和丢弃上清液。然后删除从磁立场板。
- 洗磁珠两次洗涤液1和洗涤液2（套件）的两倍。对于每个4洗涤步骤每个样品加入150μl准备洗涤液，摇匀确定速度为1分钟，移动板磁立场，捕捉珠约5分钟（或直到解决的办法是彻底清除），删除和弃去上清液。从磁立场板，然后删除，添加洗涤液，并进行清洗步骤，如前面。在最后的洗涤步骤，可能和空气的干板振动筛2分钟，在室温下珠中删除尽可能多的洗涤液。
- 洗脱缓冲液中加入50μL（套件），从珠子释放RNA和摇板振动筛上的4分钟。如前所述捕捉珠。上清现在包含分离出的RNA，这是为下游应用做好准备。
3。 RT - PCR检测禽流感病毒基质基因
开展25μL反应一步访问RT - PCR检测系统的逆转录聚合酶链反应（RT - PCR检测）（Promega公司）（从克劳斯等调整 18和Fouchier 等 22。 ）
| 核酸免费水 | 1.5μl |
| AMV / Tfl5缓冲区 5μL | |
| dNTPs | 0.5μL |
| 底漆M52C 22（10μmol） | 2.5μl |
| 底漆M253R 22（10μmol） | 2.5μl |
| 硫酸镁 （25毫米） | 7μl |
| AMV反转录酶（5u/μl） | 0.5μL |
| TFL聚合酶（5u/μl） | 0.5μL |
| RNA样品 | 5μL |
在Biometra T1的热循环PCR的条件是：最初的45分钟反转录在45 ° C，2分钟预变性94 ° C和40个循环：94℃，1分钟，56℃1分钟， 68℃2分钟。增加7分钟伸长率在68 ° C的结论放大。
4。 AI阳性样品的筛选和净化的目标片段从凝胶
- 负载2μL5倍上样染料（BioRad公司）和1％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭的1％（每100毫升凝胶2.5μl）预检染色（罗氏）6μl水混合的PCR产物2μL。
- 一个DNA大小的标准（BioRad公司的EZ负荷100 bp的阶梯）一起运行在120V 1小时凝胶，凝胶系统与可视化。见在图1中的例子。
- 选择样品扩增片段与预期大小范围（200个基点和300基点（目的片段为244 bp的），之间。6μl5倍加载染料装入这些候选人的整个PCR反应体积（〜23μl剩下2） ％溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳和运行2个小时。
- 广场上的紫外线透射（Bioblock科学）的凝胶和目视检查。参见图2中的一个例子。正确的大小，向香港海关乐队用手术刀和个人1.5 ml反应管置于凝胶。片段从凝胶净化，Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒（Zymo研究）的实例。
5。 PCR产物的测序和鉴定
- 开展Sanger测序目标片段，例如在ABI 3730毛细管音序器与ABI大染料3.1化学（美国应用生物系统公司）。准备测序反应中含有加入10μl卷10-20吴凝胶纯化模板cDNA，1.75μl5倍稀释缓冲液，0.5μL大染料V3.1预混料，1μL正向引物（M52C 20，10毫米），和ddH2O。骑自行车的条件是：初始变性1分钟，25次：10小号在96℃，在45℃和4时60分5 S ° C。净化，并准备根据您的内部协议的测序反应。
- 确定对核苷酸的数据库，如GenBank23，如基于Web的工具，如在为国家生物技术信息（NCBI，中心的爆炸造成的cDNA序列http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
6。代表性的成果：
野鸭（阿纳斯platyrhynchos）进行抽样Ottenby鸟天文台于2007年12月。从每凫一个FTA卡上的样本是在本议定书中所述。 FTA卡在船后，两年中在-20 ° C冷冻保存。克劳斯等人在隔离测试实验室相同的FTA卡样品18作为阳性对照，以及它的9个十倍串行稀释。两个阴性对照一）提取从一个空的自由贸易协定卡，以测试是否有结转的冲床，II）RT - PCR反应，核酸免费水为模板，进行测试，如果污染发生时，或在PCR反应的准备。
84样本进行了分析。图1中可以找到一个从这些84个样本的PCR产物的凝胶图片。从天然样品中的多种非特异性条带，可以观察到由于粪便中的各种微生物污染。然而，长244 bp的目标片段的引物对。整个PCR反应体积的一个子集的样品生产约正确的尺寸范围（200 bp和300 bp的之间）的片段，凝胶（图1）装上。乐队从凝胶中切的画像补充图1中可以找到。除了阳性对照，这些样本中的两个（69899和69912）新的协议。一个对NCBI核苷酸数据库的BLAST搜索AI基质基因（图3）透露他们的身份，而所有其他乐队类似细菌的序列最密切的，或者没有产生一个可读序列。
图1。 2μLPCR阳性对照产品的凝胶图片的PCR产物进行初步筛选。erial稀释的阳性对照，两个阴性对照和84泄殖腔样本被装。凝胶面板，底部面板中的48个样品中48个样品。红色箭头指示为100 bp的DNA大小标准使用的凝胶车道。图中，红色圆圈显示在预期的尺寸范围内带。蓝色圆圈表示一个非特异性扩增（左上）或低于100大小的BP（右下）的引物二聚体人工制品。
图2。与乐队之间的200个基点和300基点（bp的目标片段244），在正确的尺寸范围内的碎片样本的选择。样本选择。绿色箭头指示的阳性对照，两个红色箭头表示被确认为禽流感病毒的积极通过比较他们的cDNA序列在NCBI核苷酸数据库的样本。
图3。代表在NCBI BLAST搜索的屏幕截图。切除片段所获得的cDNA序列核苷酸数据库在NCBI网站查询。样本正确识别AI矩阵基因片段。 若要查看这个图片的大小的一个完整的版本，请点击这里 。
补充图S1。从凝胶切除选定的样品带。这张照片是从图1中描绘后，候选人之间的200 bp和300 bp的带凝胶采取切出。
Discussion
这里描述的协议提供了一个辅助方法，以屏幕为禽流感病毒的存在的粪便或类似的样品。这是特别设计，使样品采集的快速和容易。这使得它较少受过训练的人员，如猎人或野生动物管理人员，可能有助于对禽流感监测。无冷却链需要应用，虽然冻结的样品，建议在可能的情况下。室温几天，例如在运输过程中的实验室，是没有问题的FTA卡上的RNA分子，只要卡保持干燥。其他非冷却储存系统，目前正在研究社会评价，如酒精 15或胍 16日，需要特殊的运输安排，因为其危险性质。相比之下，FTA卡法不需要有害物质的航运。然而，在这方面的另一个有趣的存储介质是RNAlater™是没有危险的，无论是17。样品分析，可以在任何标准的分子实验室进行。没有特殊的设备比其他常规的PCR反应和毛细管测序是必要的。所有步骤都可以进行无生物安全级别，因为已经在样本收集潜在的病原体灭活FTA卡的抗菌和抗病毒活性。
在我们的试验与野生鸟类标本的交叉污染和随后的假阳性样品，没有观察到。然而，RNA和PCR时，它始终是最好要特别注意清洁前和后的PCR步骤的工作场所和单独的房间。在通风橱中工作，减少在实验室中的气溶胶污染的风险。移液需要进行过滤嘴。
从先前的研究同时从我们知道的84个样本中有6个是由传统的实时RT - PCR法24和 实时RT - PCR检测的Ct值是已知的相同的鸭的样本。我们的Ct值<30（显示高浓度的病毒RNA）的方法从鸭干检测的阳性标本。其他4个样本，与传统的协议的积极的Ct值> 30（不集中）和不能被检测到我们的协议。
只有具有比较高的病毒滴度的样品呈阳性，在我们的实验和方法的灵敏度，很可能是故障检测所有阳性标本的来源。此外，在目前的研究的样本量非常低，该方法可以完全开发和评估，如果进行更多的控制和严格的实验。但是，如果这些样本将被从一个偏远地区收集，传统的分析不会已经有可能在所有。此外，这些结果源于试点实验，需要进一步优化。定期-20℃冷冻样品采集后的一两年的存储期间也可能影响病毒RNA的质量。这种可能的RNA降解是一个重要的问题，处理与灭活病毒的房间温度存储时。替代液体储存上述样品遭受显着降低，从而影响分析不再延伸的病毒基因组的 16 。虽然没有在我们的研究测试，FTA卡已被证明是适合保存在其他RNA系统是非常相似的禽流感病毒，25，26的，完整的RNA分子。
Disclosures
诱捕，处理和采样鸟类进行了国家立法和由瑞典农业和研究动物伦理委员会局的批准。
Acknowledgments
我们感谢伯特Dibbits技术援助。动物育种和基因组，瓦赫宁根大学，荷兰，慷慨地在他们的实验室主办。 ，瑞典，Ottenby鸟天文台的工作人员表示感谢，诱捕和取样的绿头鸭，特别是马格努斯Hellström，马库斯 - 丹尼尔森，马格努松克里斯蒂娜安德森。我们感谢Jonatan Qvist桑妮斯文森，并在Ottenby拍摄的每阿克塞尔Gjöres，和马诺Camon在实验室内进行拍摄。丹尼尔Bengtson提供本出版物的视频部分美丽的鸭照片。使用，进一步加强疾病预防控制中心公共卫生图片库（PHIL ;材料http://phil.cdc.gov/phil/）：电子显微镜（280号;厄斯金帕尔默博士）和插图（第11823;道格拉斯约旦）的流感病毒。财政支持KNJV（荷兰皇家猎人协会），荷兰农业部，Faunafonds的STICHTING Eik信托（在荷兰），瑞典研究理事会（赠款。2007-20774）和欧共体创办Newflubird项目。 RNA提取的化学品，RNA公司Ambion公司，公司的一个厚礼。这是第245号从Ottenby鸟天文台的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
- Pulido, F. The genetics and evolution of avian migration. BioScience. 57, 165-174 (2007).
- Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists. Waterbirds. 29, 243-257 (2006).
- Taubenberger, J. K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).
- Butler, D.
- Normile, D. Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1. Science. 312, 1451-14 (2006).
- Si, Y. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns. Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).
- Si, Y. Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe. Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).
- Chen, H. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China. J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).
- Gaidet, N. Avian influenza viruses in water birds. Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).
- Krauss, S. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).
- Parmley, E. J. Wild bird influenza survey, Canada, 2005. Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).
- Wallensten, A. Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe. Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).
- Munster, V. J. Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests. J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).
- Latorre-Margalef, N. Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks. Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).
- Runstadler, J. A. Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005. Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).
- Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces. Avian Dis. 51, 965-968 (2007).
- Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA. J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).
- Kraus, R. H. S. Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues. Wildfowl. , 215-223 (2009).
- Smith, L. M., Burgoyne, L. A. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper. BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).
- Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA). Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).
- Rogers, C., Burgoyne, L. Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure. Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).
- Fouchier, R. A. M. Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W.
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).
- Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus. Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).
