Summary
Um método para preservar, detectar e seqüência de RNA a partir de vírus da gripe aviária foi validado e estendido usando naturais amostras de fezes de pássaros. Esta técnica elimina a necessidade de manter uma corrente fria e manipulação de vírus infeccioso e podem ser aplicados em uma instalação de 96 poços de alto rendimento.
Abstract
Vírus da gripe aviária (AIVs) infectar muitos mamíferos, incluindo seres humanos 1. Estes AIVs são diferentes em seus hospedeiros naturais, abrigando quase todos os possíveis subtipos virais 2. As pandemias de gripe humana originalmente derivam AIVs 3. Muitos casos humanos fatais durante os surtos de H5N1 nos últimos anos foram relatados. Ultimamente, uma cepa nova AIV relacionadas varreu a população humana, causando quatro a 'epidemia de gripe suína ". Apesar de a negociação humanos e atividade de transporte parece ser responsável pela disseminação de cepas altamente patogênicas 5, a dispersão também pode ser parcialmente atribuída a aves selvagens 6, 7. No entanto, o reservatório real de todas as cepas AIV é aves selvagens.
Em reação a isso e em face de graves perdas comerciais na indústria avícola, programas de vigilância de grande porte têm sido implementadas globalmente para coletar informações sobre a ecologia das AIVs, e instalar sistemas de alerta precoce para detectar certas cepas altamente patogênicas 8-12. Métodos tradicionais requerem virológica vírus para estar intacto e cultivadas antes da análise. Isto exige estrita cadeias de frio, com freezers e procedimentos de biossegurança pesada de estar no lugar durante o transporte. Vigilância de longo prazo é, portanto, normalmente restrita a um campo de poucos postos de perto de laboratórios bem equipados. Áreas remotas não podem ser amostrados a menos procedimentos logisticamente complicado são implementadas. Estes problemas foram reconhecidos 13, 14 e o uso de armazenamento e estratégias alternativas de transporte investigados (álcoois ou guanidina) 15-17. Recentemente, Kraus et al. 18 introduziu um método para coletar, armazenar e transportar amostras AIV, com base em um papel filtro especial. FTA cards 19 preservar RNA em uma base de armazenamento seco 20 e tornar inativa patógenos em contato 21. Este estudo mostrou que os cartões FTA pode ser usado para detectar AIV RNA na transcrição reversa-PCR e que o cDNA resultante poderia ser seqüenciado e genes de vírus e determinada.
No estudo de Kraus et al. 18 um laboratório isolado de AIV foi usado, e as amostras foram tratadas individualmente. Na extensão aqui apresentados, as amostras de fezes de aves selvagens da armadilha pato no pássaro Ottenby Observatory (SE Suécia) foram testadas diretamente para ilustrar a utilidade dos métodos em condições de campo. Captura de patos e coleta de amostras de swab cloacal é demonstrada. O protocolo atual inclui up-scaling do fluxo de trabalho de manipulação de tubo único para um projeto de 96 poços. Embora menos sensível do que os métodos tradicionais, o método de FTA cards fornece um excelente complemento para sistemas de vigilância de grande porte. Ele permite a coleta e análise de amostras de qualquer lugar do mundo, sem a necessidade de manutenção de uma cadeia fria ou normas de segurança no que diz respeito ao transporte de reagentes perigosos, como o álcool ou guanidina.
Protocol
1. Trapping pato e cloaca Swab
- Armadilha dabbling patos do gênero Anas (ou outras aves) em uma gaiola, atraindo-os com patos lure ou comida, e colocá-los em caixas de bordo individuais cartão. Tempo de transporte na caixa devem ser mantidas a um mínimo, por exemplo, através da instalação de uma estação de campo a uma curta distância para a armadilha. Circunstâncias logística pode variar em cada estudo. O conselho e aprovação do respectivo comitê de ética animais precisa ser buscado para cada novo set-up. Alternativamente, também caçador de aves tiro pode ser amostrados.
- Retire o pato da caixa, segurando suas asas apertadas ao corpo. Uma amostra caindo frescos, que estará presente na maioria dos casos, directamente a partir do fundo da caixa. Pegá-los com uma zaragatoa estéril e aplicar o líquido para um cartão de FTA Whatman. Se não, execute swabbing cloacal.
- Vire o pato em suas costas. Isto permite o acesso à cloaca e facilita a amostragem. A cloaca é uma estrutura protuberante situado abaixo do abdômen, perto da base da cauda. Uma pessoa experiente poderia prender e amostra da ave, ao mesmo tempo, ou então uma segunda pessoa pode ajudar.
- Insira cuidadosamente o plástico estéril rayon swab (Copan, Itália) cerca de 1 cm e fazer um redemoinho suave da cloaca. Rolar o swab com os fluidos da cloaca sobre a superfície de um cartão de FTA Whatman. Após a amostragem foi realizada libertação imediata dos animais é desejável.
- Seca os cartões FTA em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora, em seguida, armazenar cada amostra individualmente em sacos de papel (envelopes, por exemplo). Armazenamento é possível à temperatura ambiente, possivelmente com contas de sílica em climas úmidos. O envio e recebimento de funcionários das instituições de biossegurança pode permitir a enviar cartões FTA por correio normal, uma vez que os patógenos se tornam inativos em contato com a superfície do cartão FTA.
2. Isolamento de RNA viral
- Extrair o material de cartão de FTA, incluindo fezes / fluido cloacal. Perfura três discos com um perfurador milímetros Harris 2 e colocar todos os em um poço de uma placa de RNase 96well livre. Entre cada nova amostra, limpe o perfurador cuidadosamente com álcool e uma precisão Kim wipe (Kimtech). Sempre usar controles positivos e negativos. Um controle positivo pode consistir de uma cepa de laboratório recém-aplicado a um cartão de FTA, ou uma amostra natural, que é saber para produzir um resultado positivo. Como controle negativo, punch out discos de um cartão FTA vazio. Além disso, deixar o outro bem livre para um controle de PCR mais tarde, em sua experiência (com a água como modelo).
- Adicionar 70μl RNA solução de extracção rápida (Ambion) e sele-a placa (AbGene Thermo-Sealer). Incubar 5 minutos em um agitador placa à temperatura ambiente com a velocidade determinada que não cause spill-over (isso depende do modelo utilizado placa shaker, teste de antecedência).
- Realizar o isolamento viral RNA de acordo com protocolos do fabricante com o MagMAX-96 isolamento viral RNA kit (Ambion). Em resumo: Adicionar 130μl preparado lise / solução de ligação (do kit) a cada poço. Transferência de 50μl FTA extraído de material de cartão a cada poço. Agite placa por 1 minuto.
- Adicione a mistura preparada 20μl talão (do kit) para cada amostra e misture pipetando para cima e para baixo. Agitar na velocidade determinada por 5 minutos. Moléculas de RNA que se ligam à esferas magnéticas.
- Mova a placa para um campo magnético de 96 poços ficar para capturar as contas. Dependendo do modelo de suporte magnético utilizado, isto pode demorar mais de 5 minutos. Quando a solução se tornou completamente claro, remover e descartar o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético.
- Lave as contas duas vezes com solução de lavagem 1 e duas vezes com solução de lavagem 2 (do kit). Para cada uma das quatro etapas de lavagem adicionar solução de lavagem 150μl preparados para cada amostra, agitar durante 1 minuto na velocidade determinada, mova a placa para o suporte magnético, a captura de contas por cerca de 5 minutos (ou até que a solução é completamente claro), remover e desprezar o sobrenadante. Em seguida, retire a placa do suporte magnético, adicione a solução de lavagem seguinte, e realizar as etapas de lavagem, como anteriormente. Após a etapa de última lavagem, remover solução de lavagem, tanto quanto possível e ar seco as contas à temperatura ambiente em agitador placa por 2 minutos.
- Adicionar 50μl de tampão de eluição (do kit) para liberar a partir do RNA contas e agitar durante quatro minutos no agitador de placa. Captura de contas, como descrito anteriormente. O sobrenadante agora contém o RNA isolado que está pronto para aplicações a jusante.
3. RT-PCR da Matriz AIV Gene
Realização de transcrição reversa PCR (RT-PCR) com o One-Step RT-PCR de acesso do sistema (Promega) em 25 mL reações (ajustado de Kraus et al 18 e et al Fouchier 22..):
| Água livre de nuclease | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 tampão 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| cartilha M52C 22 (10 mM) | 2.5μl |
| cartilha M253R 22 (10 mM) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| AMV transcriptase reversa (5u/μl) | 0.5μl |
| Polimerase Tfl (5u/μl) | 0.5μl |
| Amostra de RNA | 5μl |
Condições de PCR em um termociclador T1 Biometra são: transcrição reversa inicial de 45 minutos a 45 ° C, seguido por 2 minutos de desnaturação inicial a 94 ° C e 40 ciclos de: 94 ° C por 1 minuto, 56 ° C por 1 minuto, e 68 ° C por 2 minutos. Um alongamento 7 minutos adicionais a 68 ° C conclui a amplificação.
4. Triagem para AI-amostras positivas e Purificação de Fragmentos orientado por Gel
- Carga 2μl do produto da PCR misturado com corante de carregamento 2μl 5x (BioRad) e água 6μl em um gel de agarose 1% (Roche) corado com brometo de etídio 1% (2.5μl por 100 ml de gel) para um pré-requisito.
- Executar o gel durante 1 hora a 120V, juntamente com um tamanho padrão de DNA (BioRad carga EZ 100 bp ladder), visualizar com um sistema de documentação de gel. Veja um exemplo na Figura 1.
- Selecionar amostras com fragmentos amplificados na faixa de tamanho esperado (entre 200 pb e 300 pb (fragmento alvo é 244 bp). Carregue o volume de reação toda PCR (dos quais ~ 23μl são à esquerda) desses candidatos com corante de carregamento 6μl 5x em um 2 brometo de etídio% corado agarose gel e correr por 2 horas.
- Coloque o gel em um transiluminador UV (bioblock Científico) e inspeccionados visualmente. Veja um exemplo na Figura 2. Bandas de consumo do tamanho correto gel com um bisturi e colocados em tubos individuais 1,5 ml de reação. Purificar fragmentos de gel, por exemplo com a Zymoclean DNA Gel Recovery Kit (Zymo Research).
5. Seqüenciamento e Identificação de Produtos PCR
- Realização de seqüenciamento Sanger dos fragmentos alvo, por exemplo, em um seqüenciador ABI 3730 capilar com ABI Big Dye 3,1 Química (Applied Biosystems). Prepare reações de sequenciamento em volumes contendo 10μl 10-20 ng gel-purificada modelo de cDNA, tampão de diluição 1.75μl 5x, 0.5μl Big Dye premix V3.1, uma cartilha mL para a frente (M52C 20, 10 mM), e ddH2O. Condições de ciclismo são: 1 min de desnaturação inicial, seguido por 25 ciclos de: 10 s em 96 ° C, 5 s em 45 ° C e 4 min a 60 ° C. Purificar e preparar a reação de seqüenciamento de acordo com os protocolos internos.
- Identificar seqüências de cDNA, resultando em bancos de dados de nucleotídeos, como GenBank23, por exemplo, ferramentas baseadas na web, tais como BLAST no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Resultados representativos:
Marreco (Anas platyrhynchos) foram amostradas na Ottenby Bird Observatory em dezembro de 2007. De cada um pato selvagem em uma amostra de cartão FTA foi tomada, conforme descrito neste protocolo. Após a distribuição, os cartões FTA foram mantidos em freezer a -20 ° C por dois anos. A amostra mesmo cartão FTA do laboratório isolado testado em Kraus et al. 18 foi incluído como controle positivo, bem como nove diluições de série de dez vezes isso. Dois controles negativos foram i) a extração de um cartão FTA vazio, para testar se houve carry-over da perfuração, e ii) reação RT-PCR em que água livre de nuclease foi usado como modelo, para testar se a contaminação ocorreu durante ou na preparação da reação de PCR.
84 amostras foram analisadas. Uma imagem gel dos produtos de PCR a partir desses 84 amostras podem ser encontrados na Figura 1. A partir de amostras naturais uma infinidade de bandas inespecíficas pode ser observada devido à presença de contaminações microbianas diversas nas fezes. No entanto, o fragmento alvo do par de primer é 244 bp de comprimento. O volume de reacção da PCR inteiro de um subconjunto das amostras que produziram fragmentos em cerca de faixa de tamanho correto (entre 200 pb e 300 pb) foi carregado no gel (Figura 1). Uma ilustração do que das bandas foram cortadas do gel pode ser encontrado na Figura suplementares 1. Além do controle positivo, duas dessas amostras (69.899 e 69.912) foram positivas pelo novo protocolo. A pesquisa BLAST no banco de dados NCBI nucleotide revelou sua identidade como AI matriz gene (Figura 3), enquanto todas as outras bandas se assemelhava seqüências bacterianas mais de perto, ou não deu uma seqüência legível a todos.
Figura 1. Gel imagem de uma triagem preliminar dos produtos de PCR. 2 mL do produto PCR de controle positivo, sdiluições erial do controlo positivo, dois controles negativos e 84 amostras de cloaca foram carregados. 48 amostras são mostrados no painel de gel superior, e 48 amostras no painel inferior. Setas vermelhas indicam pistas gel utilizado para 100 bp DNA de tamanho padrão. Para ilustração, círculos vermelhos mostram bandas na faixa de tamanho esperado. Círculos azuis indicam um amplicon inespecíficos (canto superior esquerdo) ou um artefato de primer dimer abaixo de 100 pb no tamanho (inferior direito).
Figura 2. Amostras de seleção de amostras com fragmentos na faixa de tamanho correto. Com bandas entre 200 pb e 300 pb (244 pb do fragmento alvo) foram escolhidos. A seta verde indica que o controle positivo, as duas setas vermelhas indicam as amostras que foram confirmados para ser AIV positiva, comparando suas seqüências de cDNA ao banco de dados NCBI nucleotídeos.
Figura 3. Captura de tela de uma pesquisa BLAST representante no NCBI. Uma das sequências de cDNA obtidas a partir dos fragmentos excisados foi consultado no banco de dados de nucleotídeos no site do NCBI. A amostra é correctamente identificadas como AI fragmento do gene Matrix. Para ver a versão completa tamanho da imagem, clique aqui.
Figura S1 suplementar. Bandas de amostras selecionadas excisadas de gel. Esta foto foi tirada a partir do gel apresentado na Figura 1 após bandas candidato entre 200 bp e 300 bp foram cortadas.
Discussion
O protocolo aqui descrito fornece um método complementar para a tela amostras fecais ou similar para a presença de AIV. Foi especialmente projetado para fazer coleta de amostras rápida e fácil. Isto torna possível para as pessoas menos treinados, como caçadores ou gerentes dos animais selvagens, para contribuir para a vigilância AI. Sem correntes legal precisam ser aplicadas, embora o congelamento das amostras é recomendado sempre que possível. A poucos dias de temperatura ambiente, por exemplo durante o transporte para o laboratório, não foram um problema para as moléculas de RNA em cartões FTA, enquanto os cartões permaneceu seco. Outros sistemas não-refrigerado de armazenamento que estão atualmente avaliadas pela comunidade de pesquisa, como o álcool de 15 ou 16 de guanidina, exigem arranjos especiais de transporte devido à sua natureza perigosa. Em contraste, o método do cartão FTA não requer o transporte de materiais perigosos. No entanto, outro meio de armazenamento interessante a esse respeito é RNAlater ™ que não é perigoso, ou 17. Análise da amostra pode ser realizada em qualquer laboratório padrão molecular. Nenhum equipamento especial que não seja usual para as reações PCR e seqüenciamento capilar foi necessário. Todas as etapas poderiam ser realizadas sem um nível de biossegurança, pois já na coleta de amostra do potencial de agentes patogênicos foram inativadas pela atividade antibacteriana e antiviral do cartão FTA.
Contaminação cruzada e subsequente amostras com falsos positivos não foram observados em nossos ensaios com amostras de aves selvagens. No entanto, quando se trabalha com RNA e PCR é sempre aconselhável prestar atenção especial para limpar locais de trabalho e salas separadas para as etapas pré e pós-PCR. Trabalhando em um exaustor diminui o risco de contaminação de aerossóis no laboratório. Pipetagem precisa ser realizado com pontas com filtro.
A partir de um estudo anterior em amostras colhidas simultaneamente a partir do patos mesmo sabemos que seis das 84 amostras foram positivas pela RealTime tradicional método de RT-PCR 24 e os valores de Ct RealTime RT-PCR são conhecidos. As duas amostras positivas detectadas pelos nossos tronco método de patos que tinham valores Ct <30 (indicando uma alta concentração de RNA viral). As outras quatro amostras que foram positivas com o protocolo tradicional tinha valores Ct> 30 (menos concentrada) e não poderia ser detectado por nosso protocolo.
Apenas amostras de vírus com títulos relativamente altos foram positivos em nosso ensaio e é provável que a sensibilidade do método foi a fonte de falha para detectar todas as amostras positivas. Além disso, o tamanho da amostra do presente estudo foi muito baixa eo método pode ser completamente desenvolvida e avaliada se mais experimentos controlados e rigorosos são realizados. No entanto, se estas amostras teriam sido coletados de uma área remota, a análise tradicional não teria sido possível a todos. Além disso, esses primeiros resultados derivam de experiências-piloto que necessitam de otimização. Um período de dois anos de armazenamento em freezer -20 ° C regulares após a coleta da amostra, provavelmente, também afetou a qualidade do RNA viral. Esta degradação RNA possível é uma questão importante quando se lida com o armazenamento em temperatura ambiente de vírus inativado. Amostras armazenadas em líquidos alternativos, como mencionado acima sofrem de significativa degradação que afeta a análise de trechos mais longos do genoma viral 16. Apesar de não ser testado em nosso estudo, cartões FTA provaram ser bem adequada para preservar as moléculas de RNA intactas em outros sistemas de RNA, que são muito semelhantes aos vírus da gripe aviária 25, 26.
Disclosures
Trapping, manuseio e amostragem de aves foram feitos seguindo a legislação nacional e foram aprovados pelo Conselho Sueco de Agricultura e da pesquisa com animais comitê de ética.
Acknowledgments
Agradecemos a Dibbits Bert para assistência técnica. O Grupo de Melhoramento Animal e Genomics, Universidade de Wageningen, Holanda, generosamente acolhido nos seus laboratórios. O pessoal do Pássaro Ottenby Observatory, na Suécia, é agradeceu captura e amostragem do marreco, em especial Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson e Stina Andersson. Agradecemos a Sanne Svensson, Jonatan Qvist e Per-Axel Gjöres para filmar em Ottenby, e Mano Camon para filmar no laboratório. Daniel Bengtson desde fotografias de pato bonito para a parte de vídeo dessa publicação. Material livre mais longe da Biblioteca de Imagens CDC de Saúde Pública (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) foi usada: A micrografia eletrônica (n º 280; pelo Dr. Erskine Palmer) e ilustração (n º 11.823; por Douglas Jordan) do vírus influenza. O apoio financeiro foi dado pelo KNJV (Royal Holanda Hunters Association), o Ministério Holandês da Agricultura, o Faunafonds ea Stichting Trusts de Eik (ambos na Holanda), o sueco Research Council (não concedem. 2007-20774) e da CE -fundada Newflubird projeto. Produtos químicos de isolamento de RNA foram um presente generoso de Ambion, Inc, a empresa RNA. Esta é a contribuição n ° 245 do Pássaro Ottenby Observatory.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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