Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

Resumo

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de estudos In vivo É apresentado. Este método capitaliza sobre o aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática celular induzida pela aplicação de um campo elétrico externo.

Resumo

A caracterização funcional de genes expressos durante o desenvolvimento da retina de mamíferos ainda é um desafio significativo. Gene targeting para gerar perda constitutivo ou condicional de nocautes função permanece custo e mão de obra intensiva, bem como demorado. Adicionando a estes desafios, retina expressa genes podem ter um papel essencial fora da retina levando a confunde involuntária ao usar uma abordagem nocaute. Além disso, a capacidade de ectopicamente expressar um gene em um ganho de experiência função pode ser extremamente valiosa quando se tenta identificar um papel na especificação célula destino e / ou diferenciação terminal.

Nós apresentamos um método para a incorporação rápida e eficiente de plasmídeos de DNA na retina do rato neonatal por eletroporação. A aplicação de impulsos elétricos curtos resultados acima de um determinado campo de força em um aumento transitório da permeabilidade da membrana plasmática, facilitando a transferência de material através da membrana ^1,2,3,4. Trabalho inovador demonstrou que eletroporação poderia ser utilizada como um método de transferência de genes em células de mamíferos, induzindo a formação de poros da membrana plasmática hidrofílica permitindo a passagem de DNA altamente carregada através da bicamada lipídica ^5. Desenvolvimento técnico contínuo resultou na viabilidade da eletroporação como um método para transferência de genes in vivo nos tecidos dos camundongos múltiplos, incluindo a retina, o método pelo qual é aqui descrito ^{6, 7, 8, 9, 10.}

Solução de DNA é injetado no espaço sub-retiniano assim que o DNA é colocado entre o epitélio pigmentado da retina e retina do mouse (P0) neonatal e pulsos elétricos são aplicadas usando um eletrodo de pinça. A colocação lateral dos olhos no mouse permite a fácil orientação do eletrodo de pinça para o alinhamento do pólo negativo necessário pole-DNA-retina-positivos. Incorporação extensiva e expressão de genes transferidos podem ser identificados por dia pós-natal 2 (P2). Devido à falta de migração lateral significativo de células da retina, regiões electroporated e não electroporated são gerados. Não electroporated regiões podem servir como controles internos histológico se for o caso.

Eletroporação da retina pode ser usado para expressar um gene sob um promotor onipresente, como o CAG, ou para perturbar a função do gene usando construções shRNA ou Cre-recombinase. Expressão mais específica pode ser conseguida através da concepção de construções com os promotores de célula específica do gene. Visualização de células electroporated é conseguido usando construções bicistronic expressando GFP ou por co-electroporating uma expressão de GFP construir. Além disso, constrói múltiplas podem ser electroporated para o estudo dos efeitos do gene combinatorial ou ganho simultânea e perda de função de genes diferentes. Eletroporação da retina também podem ser utilizados para a análise genômica de cis-regulatórias elementos, gerando construções de expressão apropriada e mutantes exclusão. Tais experiências podem ser usados ​​para identificar regiões cis-regulatórias suficiente ou necessária para a expressão gênica de células específicas ^11. Experiências potenciais são limitados apenas pela disponibilidade de construir.

Protocolo

1. Preparação plasmídeo para eletroporação

A concentração de DNA necessária para eletroporação é 5μg/μl. Isso normalmente requer os plasmídeos desejava ser amplificados em um Maxi-prep (Qiagen) ou método equivalente seguido de uma purificação e concentração do DNA com a quantidade de trabalho. Os passos seguintes descrevem a preparação de DNA com a quantidade de trabalho.

1. Alíquota de 100 mg de DNA (de Maxi prep ou equivalente) e diluir o volume de 100 mL para a facilidade de manipulação.
2. Adicionar fenol, a quantidade de fenol deve ser calculado para obter um rácio de aproximadamente 60% de DNA / volume (DNA mg: volume....

Discussão

Eletroporação in vivo representa um método rápido e eficiente para a transformação de células da retina com plasmídeos de expressão de DNA. Este método permite que o pesquisador para realizar estudos de ganho de função por ectopicamente introdução de um gene de interesse sob o controle de um promotor ubiquitously expressas ou para realizar estudos de perda de função usando construções shRNA alvo genes de interesse. Além disso, cosmídeos múltiplas podem ser electroporated simultaneamente, permitindo que o pesqui.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número Catálogo	Comentários
Tampão saturada de fenol	Invitrogen	15513-039	N / A
Clorofórmio	JT Baker	9180-03	N / A
Acetato de sódio	JT Baker	3470-05	3 M de ações
Fast Green FCF	Fisher Biotech	BP123-10	Estoque de 10%
Álcool isopropílico prep	Tyco Healthcare	6918	N / A
30 guage agulha	Terumo Medical Corp	SG2-3013	N / A
Exmire microsseringa	Ito Corporação	MS * E05	N / A
Tweezertrode (eletrodo pinça)	BTX Instrumento, Genetronics Inc.	522	N / A
Electro Praça Porator (electroporator)	BTX Instrumento, Genetronics Inc.	ECM 830	N / A
Composto outubro	Sakura Finetek EUA	4583	N / A