Bacterioplâncton ambientais são incubados com um modelo de carbono orgânico dissolvido composto (DOC) e um reagente rotulagem DNA, bromodeoxiuridina (BrdU). Depois, DOC-degradante células são separadas da comunidade em massa com base em sua incorporação BrdU elevada usando separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Estas células são então identificadas por análises subseqüentes molecular.
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Artigo de método
Bromodeoxiuridina Labeling (BrdU) e separação de células subseqüentes Fluorescence Activated de Cultura independente de Identificação de carbono orgânico dissolvido de degradação bacterioplâncton
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Micróbios são agentes importantes mediando a degradação do carbono dissolvido numerosos orgânico (DOC) substratos em ambientes aquáticos. No entanto, a identificação da taxa de bactérias que transformam a grupos específicos de DOC na natureza representa um desafio técnico.
Aqui nós descrevemos uma abordagem que os casais bromodeoxiuridina incorporação (BrdU), separação de células ativadas por fluorescência (FACS), e 16S rRNA gene baseada em análise molecular que permite que a cultura independente de identificação do bacterioplâncton capazes de degradar compostos DOC uma específicos em ambientes aquáticos. Microcosmos bacterioplâncton triplicado são configurados para receber tanto BrdU e um composto modelo DOC (DOC alterações), ou apenas BrdU (sem adição de controle). Substitutos BrdU as posições de timidina no DNA recentemente sintetizado bacteriana e BrdU marcado DNA pode ser prontamente 1,2 immunodetected. Através de uma de 24 horas de incubação bacterioplâncton, que são capazes de usar o composto adicionado DOC são esperados para ser seletivamente ativado, e, portanto, têm níveis mais elevados de incorporação de BrdU (células HI) que os não-responsivos células nas alterações DOC e células em no- Além controles (células de baixa incorporação de BrdU, células LI). Depois de imunodetecção de fluorescência, as células HI são distinguidos e separados fisicamente das células LI por separação de células ativadas por fluorescência (FACS) 3. Ordenado DOC-responsiva (células HI) são extraídos de DNA e identificados taxonomicamente por meio de 16S rRNA gene subseqüentes análises baseadas incluindo PCR, clonagem e sequenciamento de construção da biblioteca.
Protocolo
1. Processamento de amostra de água
- Filtro de água 10L ambiental através de uma filtros mM de poros de tamanho de membrana para remover partículas grandes e bacteriovores. Recolher o filtrado em um garrafão de água.
- Transferência de 36 ml cada filtrado em 3 tubos estéreis Eppendorf (50 ml) contendo 4 ml de solução recém-preparada de paraformaldeído (PFA; 10%). Incubar por 2 horas em temperatura ambiente para preservar as células. Coletar células para 0,22 mícrons de tamanho de poros filtros de membrana branca por filtração a vácuo. Lavar o filtro, passando de 10 ml tampão fosfato (PBS) através do filtro por filtração a vácuo. Rotular os filtros c....
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Discussão
Casais a nossa abordagem incorporação de BrdU, FACS e 16S rDNA para permitir a análise em nível de espécie de identificação do bacterioplâncton que metabolizam os componentes individuais DOC em ambientes aquáticos. O ensaio de incorporação BrdU rótulos células bacterianas com base em atividades metabólicas, que permite a análise somente em bactérias ativas e, portanto, não inclui as células adormecidas. Em nossa abordagem, a incorporação é BrdU em bactérias in situ immunodetected e que têm diferentes n.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Financiamento deste projeto foi fornecido pelo National Science Foundation concede OCE1029607 (para XM) e MCB0702125 (para MAM) eo Gordon e Betty Moore Foundation (a MAM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Nome | Tipo | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| BrdU | Reagente | Sigma | B5002-5G | |
| Lisozima | Reagente | Sigma | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagente | Sigma | P2308-25mg | |
| In Situ Proliferação Celular Kit, FLUOS | Conjunto | Roche | 11810740001 | Consumir mais de Anti-BrdU-FLUOS e tampão de incubação por reação do que o sugerido pelo fabricante. |
| Quadro Seal-Chambers Incubação | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Filtros de membrana de policarbonato (142 mm de diâmetro, 1,0 mM de poros de tamanho) | Material | Millipore | FALP14250 | |
| Filtros de membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro, 0,2 m de poros de tamanho) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Conjunto | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick extração de gel kit | Conjunto | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Conjunto | Epicentro | FS99060 |
Referências
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
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Reimpressões e permissões
