O biarsenical corantes Flash e ReAsH se ligam especificamente a motivos tetracysteine em proteínas e pode seletivamente rótulo proteínas em células vivas. Recentemente, esta estratégia de rotulagem tem sido usado para desenvolver sensores de conformações de proteínas diferentes ou estados oligoméricos. Descrevemos a abordagem rotulagem e métodos para analisar quantitativamente vinculativo.
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Artigo de método
ReAsH / Flash Rotulagem e Análise de Imagem Sensor de Proteínas em Células Tetracysteine
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteínas fluorescentes e corantes são ferramentas essenciais para o estudo da localização de proteínas, tráfico e função nas células. Enquanto que as proteínas fluorescentes, como a proteína fluorescente verde (GFP) têm sido amplamente utilizados como parceiros de fusão para proteínas para monitorar as propriedades de uma proteína de interesse 1, os desenvolvimentos recentes com etiquetas menores permitem novas funcionalidades de proteínas a ser examinada em células, tais como mudança conformacional e proteína-associação 2, 3. Um sistema de tag pequenas envolve um motivo tetracysteine (CCXXCC) geneticamente inserido em uma proteína-alvo, que se liga aos corantes biarsenical, ReAsH (vermelha fluorescente) e Flash (verde fluorescente), com alta especificidade, mesmo em células vivas 2. O TC / biarsenical sistema de corante oferece muito menos restrições estérico à proteína do hospedeiro do que proteínas fluorescentes que tem possibilitado várias novas abordagens para medir a mudança conformacional e interações proteína-proteína 4-7. Recentemente, desenvolveu uma nova aplicação de tags TC como sensores de oligomerização em células que expressam mutante, que quando sofre mutação agregados nos neurônios em Huntington doença 7. Huntingtina foi etiquetado com dois corantes fluorescentes, uma uma proteína fluorescente para rastrear a localização de proteínas, e um segundo a marca TC que obriga apenas corantes biarsenical em monômeros. Assim, mudanças na co-localização entre as proteínas e reatividade corante biarsenical habilitado conteúdo oligômero submicroscópicas ser espacialmente mapeadas dentro das células. Aqui, descrevemos como rotular TC-tagged proteínas fundida a uma proteína fluorescente (Cherry, ou GFP PCP) com flash ou ReAsH viver em células de mamíferos e como quantificar a fluorescência de duas cores (Cherry / Flash, PCP / Flash ou GFP / combinações ReAsH).
Protocolo
1. Preparação de células para a rotulagem com ReAsH / Flash
- Usando métodos de cultura de células padrão para sua linha de celulares de interesse, prepare uma cultura de células aderentes diretamente em um slide de imagens ao vivo de células pronto para transfecção.
- Transfectar seu plasmídeo gene TC-tagged contendo de interesse de acordo com seu método de transfecção de escolha.
Note que é importante o uso de controles positivos e negativos para avaliar a extensão da ligação específica para as tags TC, para avaliar bleedthrough de fluorescência entre os canais ao coletar micrografias confocal. Assim, para duas co....
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Discussão
A abordagem para localização de proteínas rótulo com uma proteína fluorescente e propriedades conformacionais com um corante segundo oferece um grande potencial para o mapeamento de onde conformações diferentes de proteínas acumulam nas células e eventos que alteram a dinâmica da conformação protéica. ReAsH / Flash foi usado primeiramente como um sensor na célula para o dobramento de proteínas dos mamíferos celular proteína ácido retinóico-binding I 4. Neste exemplo, o Flash vinculado a um tag TC projetado em.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por doações de DMH e TDM (subvenções NHMRC projeto). DMH é um companheiro Grimwade, financiado pelo Fundo Miegunyah.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número Catálogo | Comentários |
| 8-μ bem-slides | Ibidi | 80826 | Encontramos estas câmara de slides a ser particularmente útil para a cultura de células para geração de imagens. |
| TC-FLASH II na célula Detecção Tag Tetracysteine Kit * * * fluorescência verde para a imagem latente em células vivas | Invitrogen | T34561 (Flash) ou T34562 (ReAsH) | |
| Solução de Hanks salina balanceada | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5mL | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
Referências
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C.
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Reimpressões e permissões
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