Medição bioquímicos da Hipóxia Neonatal

Resumo

Um método é descrito para medir marcadores bioquímicos de hipóxia-isquemia neonatal. A abordagem utiliza cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa (GC / MS).

Resumo

Isquemia hipóxia neonatal é caracterizada por perfusão sangüínea inadequada de um tecido ou uma falta sistêmica de oxigênio. Esta condição é pensado para causar / agravar bem documentados distúrbios incluindo comprometimento neurológico neonatal ^1-3. Trifosfato de adenosina diminuiu a produção ocorre devido à falta de fosforilação oxidativa. Para compensar essa energia moléculas estado privados contendo ligações fosfato de alta energia são ^duas degradadas. Isso leva a aumento dos níveis de adenosina, que é posteriormente degradado a inosina, hipoxantina, xantina e, finalmente, o ácido úrico. As duas últimas etapas deste processo de degradação são realizadas por xantina oxidoredutase. Esta enzima existe sob a forma de xantina desidrogenase em condições normóxica mas é convertida em xantina oxidase (XO), sob hipóxia-reperfusão circunstâncias ^{4, 5.} Ao contrário de xantina desidrogenase, XO gera peróxido de hidrogênio como um subproduto da degradação da purina ^{4, 6.} Este peróxido de hidrogênio em combinação com outras espécies reativas de oxigênio (ROS) produzidas durante a hipóxia, oxida o ácido úrico a formar alantoína e reage com membranas lipídicas para gerar malondialdeído (MDA) ^7-9. A maioria dos mamíferos, os seres humanos isentos, possuem a enzima uricase, que converte ácido úrico em alantoína. Nos seres humanos, no entanto, alantoína só pode ser formado por ROS mediada oxidação do ácido úrico. Devido a isso, alantoína é considerado um marcador de estresse oxidativo em humanos, mas não os mamíferos que têm uricase.

Descrevemos os métodos empregando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e cromatografia gasosa espectrometria de massa (GCMS) para medir marcadores bioquímicos de isquemia hipóxia neonatal. O sangue humano é usado para a maioria dos testes. Sangue animal também pode ser usado, reconhecendo o potencial de uricase gerado alantoína. Metabólitos de purinas estavam ligados à hipóxia já em 1963 ea confiabilidade de hipoxantina, xantina e ácido úrico como indicadores bioquímicos de hipóxia neonatal foi validada por vários pesquisadores ^10-13. O método de HPLC utilizado para a quantificação de compostos de purina é rápido, confiável e reprodutível. O método de GC / MS utilizado para a quantificação de alantoína, um marcador relativamente novo de estresse oxidativo, foi adaptado de Gruber et al ^7. Este método evita certos artefatos e requer baixos volumes de amostra. Métodos utilizados para a síntese de MMDA foram descritos em outros ^{14, 15.} GC / MS com base quantificação de MDA foi adaptado a partir Paroni et al. e Cighetti et al. ^{16, 17.} Xantina oxidase atividade foi medida por HPLC, quantificando a conversão de pterin para isoxanthopterin ^18. Esta abordagem provou ser suficientemente sensível e reprodutível.

Protocolo

1. Coleta e Processamento de

1. Coletar amostra de sangue em um tubo de EDTA K3E 6ml K3 que é mantido no gelo.
2. Dentro de 2 min de coleta, centrifugar a amostra a 4 ° C a 1500 g por 10 min.
3. Transferir o sobrenadante (plasma) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Centrífuga a 4 ° C em 18.000 g por 30 min.
5. Remove as alíquotas sobrenadante e transferi-los em tubos de microcentrífuga separado para purina (200μl), alantoína (50μl), MDA (100μl) e análise (120μl) XO. Tenha cuidado para não contaminar as amostras com células vermelhas do sangue. Você pode precisar de ajustar os volumes de plasma de MDA, XO e purinas baseado....

Discussão

Os métodos descritos aqui permitir a avaliação da isquemia hipóxia neonatal. Este protocolo combina as medições de marcadores de privação de energia (ATP), stress oxidativo, dano oxidativo e atividade de enzimas para obter uma imagem global bioquímicos da presença ou até mesmo o grau de isquemia hipóxica. Apesar da utilidade deste método, existem limitações em potencial. Em primeiro lugar, que leva cerca de 1-2 ml de sangue para coletar plasma suficiente para executar todos os ensaios. Este não será um problema em adult.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
6ml K3E EDTA K3 tubo	Fisher Scientific	2204061
Centrífuga 5702R	Fisher Scientific	05413319	Com 13 e adaptador de 16MM
Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml	EUA Scientific	1615-5599
2-aminopurina	Sigma-Aldrich	A3509
Varian Cary 100 espectrofotômetro	Agilant Technologies	0010071500
Savant SpeedVac	Thermo Scientific	SC210A-115
Micron dispositivo centrífugo filtro	Fisher Scientific	UFC501596
Supelcosil Coluna LC-18-S	Sigma-Aldrich	58931
Supelcosil LC-18-S Supelguard cartucho e titular	Sigma-Aldrich	59629
HPLC	Águas
Vial GCMS	Fisher Scientific	03376607
DL-Alantoína-5 -13 C; 1 -15 N	CDN Isótopos	M-2307	Lot # L340P9
MTBSTFA	Thermo Scientific	48920
Piridina	Sigma-Aldrich	270970
5973E GC / MSD	Agilent Technologies	G7021A	Part # 5975E para GC / MS
3-Ethoxymethacrolein	Sigma-Aldrich	232548
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S5881
Diclorometano	Sigma-Aldrich	270997
Benzeno	Sigma-Aldrich	401765
Diisopropil éter	Sigma-Aldrich	38270
BHT	Sigma-Aldrich	B1378
Etanol	Sigma-Aldrich	459844
Fenil	Sigma-Aldrich	P26252