Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

Resumo

Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização terminal In vivo.

Resumo

Desenvolvimento de um circuito precisa olfativa depende de projeção precisa de olfactory neurônio sensorial (OSN) axônios a seus alvos synaptic no bulbo olfativo (OB). Os mecanismos moleculares da OSN crescimento do axônio e segmentação não são bem compreendidos. Expressão do gene manipulação e posterior visualização dos axônios OSN solteiras e seus terminais morfologia arbor até agora têm sido um desafio. Para estudar a função dos genes ao nível única célula dentro de um prazo especificado, que desenvolveu uma técnica baseada lentiviral para manipular a expressão do gene em ORS in vivo. Partículas Lentivirus são entregues ORS por microinjeção no epitélio olfativo (OE). Cassetes de expressão são, então, permanentemente integrado no genoma da ORS transduzidas. Expressão da proteína fluorescente verde identifica ORS infectadas e delineia sua morfologia inteiro, incluindo o terminal axonal arbor. Devido ao tempo de resposta curto entre microinjeção e detecção de repórter, estudos da função do gene pode ser focado dentro de um período muito estreito de desenvolvimento. Com este método, nós temos detectado expressão GFP dentro de apenas três dias e até três meses após a injeção. Temos conseguido tanto a expressão mais e shRNA mediada knock-down por microinjeção lentiviral. Este método fornece morfologias detalhada dos corpos celulares e axônios OSN no nível da célula única in vivo e, portanto, permite a caracterização da função de genes candidatos durante o desenvolvimento olfativo.

Protocolo

1. Preparação

Este procedimento é de biossegurança nível 2, portanto, todas as seguintes preparações são feitas em uma cobertura de risco biológico, onde o procedimento de microinjeção é realizada.

1. Preparar e pré-aquecimento a 37 ° C waterbed: Encha um saco de armazenamento de plástico com água - selo e fixado em um bloco de aquecimento esvaziado incubadora. Isso permitirá que os ratos se recuperar após a injecção.
2. Encher um recipiente de resíduos de risco biológico com lixívia a 10% para um volume adequado para imersão de todos os resíduos desse procedimento.
3. Prepare um pequeno prato aberto de etanol 70% e um segundo prato com ddH2O esterilizado e coloque no gabinete de segurança biológica.
4. Esterilizar uma seringa Hamilton 5μL capacidade com uma agulha de 33 gauge por pulverização para baixo do corpo e da agulha com álcool 70% com o êmbolo puxado para fora todo o caminho. Repetidamente aspirado de etanol a partir do prato e ejetá-lo todo o caminho, pelo menos, 5 vezes.
5. Lave o cartucho seringa, aspirando e expulsando água estéril, pelo menos, 5 vezes. Lugar seringa com segurança de lado na capa cultura e deixe-a secar.
6. Remover ações virais de -80 ° C de armazenamento freezer e colocar no gelo para permitir o descongelamento. Microinjeção requer 2μL de estoque de vírus por mouse em um título de 10 ⁹ unidades infecciosas / mL. Lentivírus podem ser obtidas de fontes comerciais ou produzidos no laboratório de acordo com o protocolo estabelecido (Lois et al., 2002).
7. Prepare uma etapa de injeção que fornece uma área elevada acima da superfície do capô - pode usar uma placa de cultura 10 centímetros coberto com uma folha de Kimwipe.
8. Organizar toalhetes com álcool, perto da estação de injeção.

2. Microinjeção de partículas lentiviral no epitélio olfativo

Todos os procedimentos com animais realizados neste método são feitas de acordo com IACUC diretrizes aprovadas. O Mus musculus cepa C57BL/6J é o modelo animal usado em todos os experimentos demonstraram aqui.

1. Anestesiar os filhotes de rato por hipotermia, tendo um rato filhote de cachorro (P0-P3) fora da gaiola e colocar o filhote em uma luva de cut-aberto no gelo por 5 minutos.
2. Enquanto espera para o filhote de cachorro para ser totalmente anestesiado, 2μL aspirado de estoque viral dentro da seringa Hamilton esterilizados.
3. Posicione o mouse em cima do filhote o estágio de injeção. Puxe a pele longe do topo da cabeça ao ouvido, em direção ao topo do pescoço. Este deve fornecer uma superfície da pele ensinou sobre a cavidade nasal e vai facilitar a injeção.
4. Inserir a agulha através da parte superior da cavidade nasal cerca de 3 mm abaixo da superfície da pele para atingir o epitélio olfativo. Microinject 0.5μL de solução de vírus por um tiro, a escolha de dois locais de cada lado, esquerdo e direito (quatro injeções total por mouse = 2μL de vírus necessário). Os locais de injecção devem ser escalonados para além um do outro. Para a segmentação de locais de injecção adequada, pesquisa a superfície dorsal do crânio para o contorno do bulbo olfatório. Essa linha é pouco visível ao nascimento através da pele semi-translúcidas e crânio. Para fazer com que duas injeções por lado, um objetivo a injeção apenas um esboço rostral do bulbo em um eixo medial. Faça a inserção segunda lateral para o contorno do bulbo, mas certifique-se o ângulo de injeção medialmente de modo que você pode atingir o epitélio olfativo que reside ventralmente debaixo da lâmpada. Evitar penetrar no bulbo olfatório!
5. Secar qualquer solução de vírus residual ou de sangue que pode escapar do local da injeção ou aberturas narina usar uma Kimwipe. Imediatamente dispor de Kimwipes no recipiente de líquido diluído bleach biohazard.
6. Posicione o mouse injetado para a incubadora waterbed.
7. Repita os passos 1-4 para todos os ratos para ser injetado, lembrando que você vai precisar de cerca 2μL de estoque de vírus por mouse.
8. Vamos recuperar os ratos na incubadora waterbed por 30 minutos antes de devolvê-los nas suas gaiolas originais de nidificação.
9. Dispor de estágio microinjeção, wipes saneantes e quaisquer produtos de papel extra de limpeza na alienação alvejante biohazard.
10. Limpe a seringa Hamilton por aspiração repetida e ejeção de etanol e água, em seguida, como foi feito nas etapas de preparação. Retirar a seringa para secar.
11. Para a eficiência máxima de transdução de repetir esse procedimento novamente em 4 horas. ORS infectados pode ser visualizado em todo o comprimento da célula em apenas três dias.

3. Imuno-histoquímica de flutuar seções bulbo olfatório

1. Sacrificar o rato injetado no ponto de tempo desejado e fixar o tecido de perfusão com paraformaldeído a 4%. Dissecar o OB. Incubar em paraformaldeído durante a noite e, em seguida, sacarose 30% em PBS durante a noite. Incorporar em outubro meio de incorporação em gelo seco.
2. Cortes coronais OB são obtidos em 60μm de espessura usando um criostato. Varrer seções lâmpada em uma placa de cultura com 10 centímetros de 5ml 1x PBS (pH 7,4). Seções devem ser mantidos flutuando em PBS para permitir a outubro dissolve. Transferência de seções flutuantes e PBS em um frasco de 50 ml cônico.
3. Permitir seções para se depositar no fundo do frasco. Vácuo off PBS sem sugando todas as seções. Enxágüe secções de tecido com PBS 20mL. Repita os passos resolver e aspiração. Ressuspender tecido com 10 ml de PBS e seções de transferência flutuante para um frasco de 15mL cônico para imunocoloração. Uma vez que as secções de tecido se instalaram, vácuo off PBS sobrenadante sem perturbar o tecido. Ressuspender seções com 0,3% Triton X-100 em 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) permitindo que o detergente para perfurar as membranas celulares. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Vácuo fora o sobrenadante e repetir a incubação com PBS-Tx duas vezes.
4. Incubar cortes de tecido, em 10ml de solução de bloqueio (soro de cavalo de 5% em PBS-Tx) por duas horas à temperatura ambiente.
5. Solução de lavagem de bloqueio, pelo menos, duas vezes com PBS-Tx de 15 minutos cada em temperatura ambiente.
6. Prepare 2 mL de uma solução de anticorpo primário em PBS-Tx. Ver Reagentes e Equipamentos para a seção de anticorpos utilizados neste experimento.
7. Substituir lavagem PBS-Tx segundo bloqueio com solução de anticorpo primário. Incubar em uma plataforma de balanço devagar (~ 30rpm) a 4 ° C por 24-48 horas para assegurar uma penetração completa nas seções 60μm flutuante.
8. Após a incubação, a solução anticorpo primário pode ser recuperada com cuidado, utilizando uma pipeta e armazenados a 4 ° C para a reutilização de até duas vezes mais dentro de duas semanas sem qualquer perda significativa de intensidade da coloração.
9. Lavar seções três vezes em PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente com rotação suave (~ 30rpm).
10. Prepare 2 ml de diluição do anticorpo secundário em PBS-Tx. Vácuo fora da última lavagem, e adicione a solução de anticorpo secundário para as seções do tecido. Envolva a parte externa do frasco de coloração em papel alumínio para bloquear a luz, o que pode causar fotobranqueamento fluoróforo. Lugar envolto frasco em uma plataforma de balanço devagar e incubar a 4 ° C durante a noite.
11. Eliminar a solução anticorpo secundário por aspiração de distância. Lavar seções uma vez com PBS-Tx de 20 minutos cada em temperatura ambiente. Enxágüe duas vezes adicionais com PBS (pH 7,4) por 20 minutos cada em temperatura ambiente. Monte as secções de tecido manchado em lâminas de vidro usando Fluoromount G.
12. Tela através de cortes corados por axônios OSN positivamente infectados e termini axônio com um microscópio de fluorescência.
13. Para construir uma visão tridimensional de um rotulados OSN axônio e arbor terminal, fazer uma série de secções ópticas através da profundidade 60μm da fatia de tecido-alvo OB (ao longo do eixo z), utilizando microscopia confocal.
14. Esta pilha de Z-seção de imagens podem posteriormente ser projetada em conjunto para reconstruir uma perspectiva de 360 ​​° de rotação de um único axônio rotulados OSN, incluindo terminal detalhes arbor na sua totalidade. Qualquer um único ângulo de rotação podem ser capturados e exportados como um arquivo de imagem (ou seja, JPG, TIFF) para a apresentação formato 2D.

4. Resultados representante

Com os métodos descritos aqui, pode converter neurônios sensoriais olfativos por lentivírus in vivo. Temos até o momento visualizado ORS infectados com GFP e repórteres mCherry fluorescentes, bem com uma tag-myc proteína de fusão através de imunocitoquímica. Esta técnica oferece uma abundância de ORS infectados. Ainda assim, transdução ocorre esporadicamente o suficiente para fornecer ORS etiquetadas individualmente, permitindo assim a análise da morfologia única célula. Axônios e os terminais do axônio são gravadas dentro de seções de tecido OB no meio seu ambiente nativo através de microscopia confocal (Figura 1). Toda a OSN axônio terminal arbor geralmente pode ser cativado dentro de uma seção de 40 50 ìm óptica. Alta ampliação dos terminais do axônio infectados OSN permite a análise detalhada da morfologia arbor axonal na camada glomerular.

Figura 1. Trajetória de um único neurônio sensorial olfativa axônio e seu terminal arbor. A) A seção coronal do bulbo olfativo de um rato P7 mostrando a camada de nervos olfativos (ONL) histoquímica para OMP (vermelho) e da camada glomerular (GL) imunocoradas com ambas as OMP e Vglut2 (cinza). Um axônio único neurônio sensorial olfativa expressando GFP (verde) viaja dentro do ONL e penetra na estrutura glomerular. B) O axônio terminal morfologia arbor dentro do glomérulo claramente evidenciado pela expressão GFP. Vglut2 co coloração cinza-in ilumina a área total glomular dentro do qual a GFP positivas axônio elabora um aborto terminal. C) Lentivirus ORS infectados expressando GFP (verde) no OE. O cytostructure do epitélio olfativo é mostrado com coloração DAPI (azul). Expressão GFP permite a visualização de corpos celulares OSN e seus processos celulares no OE. D) Um axônio OSN e sua morfologia terminal com Rap1GAP2 expressão knock-down por shRNA. Lentivírus carregando um cassete de expressão dupla com Rap1GAP2 shRNA sob o promotor U6 mouse e GFP sob umPromotor CMV foram aplicados ao OE. Infectados terminais do axônio olfativa exibiu uma mais simplificada terminal arbor quando comparada com a do controle apenas GFP. Bar = 20Hm.

Discussão

Microinjeção de resultados lentivírus de transferência permanente de construções de gene em OSN DNA genômico. Essa abordagem nos permite realizar manipulações de curto prazo ou longo prazo de genes candidatos via superexpressão ou mediada shRNA knock-down. Além disso, podemos fluorescente ORS rótulo único em uma linha de rato transgênico existentes para observar co-localização das populações receptor de odorante. Microinjeção é necessário para a transdução lentiviral de ORS. Nós tentamos rubor suspensão lentivírus na ca...

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