Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

Resumo

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Resumo

CCE são células cilíndricas sensório-motor localizado no órgão de Corti, o órgão auditivo dentro do ouvido dos mamíferos interior. O nome de "células ciliadas" deriva do seu pacote característica apical de estereocílios, um elemento crítico para a detecção e transdução de energia sonora ^1. CCE são capazes de mudar de forma-alongado, encurtar e dobre-em resposta à estimulação elétrica, mecânica e química, uma resposta motora considerada crucial para a amplificação coclear dos sinais acústicos ^2.

Estimulação OHC induz duas diferentes respostas motile: i) eletromotilidade, motilidade rápida aka, mudanças no comprimento na faixa de microssegundos derivados com motor eléctrico mudanças conformacionais em proteínas motoras densamente no OHC membrana plasmática, e ii) a motilidade lenta, muda de forma no milissegundos para segundos gama envolvendo reorganização do citoesqueleto ^{2, 3.} OHC de flexão é associado com eletromotilidade, e resultar tanto de uma distribuição assimétrica de proteínas motoras na membrana plasmática lateral, ou estimulação elétrica assimétrica dessas proteínas motoras (por exemplo, com um campo elétrico perpendicular ao eixo longitudinal das células) ^4. Estímulos mecânicos e químicos induzem essencialmente lento respostas móveis, mesmo que as mudanças nas condições iônica das células e / ou seu ambiente também podem estimular a membrana plasmática-embedded do motor proteínas ^{5, 6.} Desde respostas OHC móveis são um componente essencial do amplificador coclear, a análise qualitativa e quantitativa dessas respostas móveis em freqüências acústicas (cerca de 20 Hz a 20 kHz em humanos) é um assunto muito importante no campo da audição investigação ^7.

O desenvolvimento da nova tecnologia de imagem que combina alta velocidade câmeras de vídeo, sistemas baseados em LEDs de iluminação, e software de análise sofisticada imagem agora fornece a capacidade de executar qualitativa confiável e estudos quantitativos da resposta móveis de CCEs isolado a um campo elétrico externo alternada (EAEF) ^8. Esta é uma técnica simples e não invasivo, que contorna a maioria das limitações das abordagens anteriores ^9-11. Além disso, o sistema de iluminação baseada em LED proporciona brilho extremo com insignificantes efeitos térmicos nas amostras e, por causa do uso de microscopia de vídeo, resolução óptica é de pelo menos 10 vezes maior do que com as técnicas convencionais de microscopia de luz ^12. Por exemplo, com a configuração experimental descrito aqui, mudanças no comprimento das células de cerca de 20 nm pode ser rotineiramente e de forma confiável detectados em freqüências de 10 kHz, e esta resolução pode ser melhorada em freqüências mais baixas.

Estamos confiantes de que essa abordagem experimental ajudará a ampliar nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes a motilidade das CCE.

Protocolo

1. Isolamento de CCE

1. Iniciar este procedimento colhendo ossos temporais de cobaias, ratos ou o seu modelo de mamíferos.
2. Em seguida, abra os ossos temporais usando uma pinça martelo, a fim de expor a cóclea, e mergulha-as na Leibovitz L-15. Remover o excesso de osso com cuidado, mantendo a casca óssea intacta. Considerando que este é um procedimento geral aplicável aos ossos temporais de qualquer espécie de mamíferos, pequenas mudanças com a técnica pode ser necessária quando se lida com ossos de animais muito pequenos. Em animais velhos a bula é geralmente calcificada, introduzindo uma complicação adicional ao procedimento.
3. Sob observaç....

Discussão

O método experimental aqui apresentado permite estimar respostas OHC móveis na faixa de kHz sem qualquer restrição ao movimento da célula. Protocolos de estimulação diferentes, marcadores adicionais (microesferas), bem como alterações na orientação da célula em relação ao campo elétrico, torná-lo possível investigar novos aspectos da motilidade das CCE, com um nível de detalhes anteriormente inacessíveis. Outros métodos, por exemplo, aqueles que usam fotodiodos ⁹ ou laser Doppler vibrometria ^10, re.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Leibovitz L-15	Gibco	21083
Colagenase (tipo 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL em L-15