Os procedimentos de animais descritos aqui foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Departamento de Recursos de Animais de Laboratório, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, Nova York.
NOTA: Camundongos machos a serem dissecados para isolar próstatas ou tumores de próstata para geração de organoides devem ter atingido pelo menos a idade de maturidade sexual - cerca de 8 a 10 semanas de idade. As idades específicas dos camundongos podem variar entre os estudos. Alguns fatores a serem considerados ao escolher a idade incluem alterações dependentes da idade nas populações de células da próstata, expressão dependente da idade de transgenes Cre específicos impulsionados por promotores e taxa de progressão do tumor de próstata em um GEMM específico.
NOTA: A Figura 1 mostra uma descrição pictórica do procedimento para geração de organoides tumorais.
1. Preparação
- Prepare o meio organoide da próstata do camundongo de acordo com Drost et al. com as seguintes alterações. Use meio condicionado em vez de proteínas recombinantes para Noggin e R-Spondin e use uma concentração final de 1% (v/v), em vez de 10%, para Noggin e R-Spondin-Spondin.
OBSERVAÇÃO: As células HEK293 transfectadas de forma estável com HA-mouse Noggin-Fc ou HA-mouse Rspo1-Fc são usadas para produzir meio condicionado Noggin ou R-Espondina Essas linhagens celulares foram um presente do Laboratório Calvin Kuo da Universidade de Stanford.
- Prepare a solução de digestão em um tubo de 15 mL diluindo 20 mg / mL de colagenase II com meio DMEM / F12 (+++) avançado até uma concentração final de 5 mg / mL. Adicione o inibidor de rocha Y-27632 à solução de colagenase II a uma concentração final de 10 μM.
OBSERVAÇÃO: A proporção de tampão de digestão para tecido é de 1 mL para 50 mg, que usamos de acordo com Drost et al.
2. Picagem e digestão do tecido tumoral
- Na capa de cultura de células, coloque o tecido tumoral da próstata em uma placa de cultura estéril de 10 cm, disseque e descarte o tecido necrótico.
- Pique o tecido tumoral de próstata restante em cubos de 1 mme 3, segurando os pedaços de tecido com a pinça curva estéril e cortando com uma tesoura de dissecação.
- Coloque os pedaços de tumor picados no tubo de 15 mL com o tampão de digestão, recolhendo-os com o lado curvo da pinça. Digerir o tecido tumoral a 37 °C com agitação durante 1,5 a 2 h. Verifique o progresso da digestão a cada 20 min.
OBSERVAÇÃO: Neste momento, retire pelo menos 2 mL de matriz do armazenamento a -20 °C e descongele no gelo. Alíquotas de 1 mL de matriz levarão aproximadamente 3 h para descongelar.
- Após a digestão dos tecidos, centrifugue o tubo a 175 x g durante 5 min a 4 °C para formar um sedimento celular.
- Remova o sobrenadante, sacuda o tubo para soltar o pellet celular e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de tripsina pré-aquecida suplementada com 10 μM de inibidor de rocha Y-27632. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C por 5 min.
- Após a incubação, pipete para cima e para baixo 5 vezes com uma ponta P1000 padrão. Retorne o tubo ao banho-maria a 37 °C por mais 5 min e repita a etapa 2.6.
OBSERVAÇÃO: Neste momento do procedimento, aqueça uma placa de cultura de células estéril de 6 poços, colocando-a em uma incubadora a 55 ° C.
3. Contagem de células e ressuspensão na matriz
- Lave as células adicionando 9 mL de AdDMEM/F12 (+++) frio e centrifugue o tubo a 175 x g por 5 min a 4 °C.
- Após a centrifugação, remova o sobrenadante, sacuda o tubo para soltar o pellet e lave as células novamente adicionando 10 mL de AdDMEM / F12 (+++) frio. Centrifugar o tubo a 175 x g durante 5 min a 4 °C.
- Após a centrifugação, remova o sobrenadante, sacuda o tubo para soltar o pellet, ressuspenda as células em 1 mL de AdDMEM/F12(+++) e conte o número de células usando um hemocitômetro de acordo com o procedimento padrão.
- Sete a oito cúpulas cabem em um poço de um prato de 6 poços quando os organoides são revestidos em matriz por meio de gota. Aproximadamente 200 μL de matriz produzirão 7-8 cúpulas. Decida quantos poços de organoides são necessários para fins experimentais futuros e calcule o volume de matriz necessário. Em seguida, calcule o volume de solução contendo células necessário para ter uma concentração final de 1,0 x 106 células/mL de matriz.
- Após a contagem das células, centrifugue a 175 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar o sobrenadante, sacudir o tubo para soltar o sedimento e ressuspender as células no volume da matriz calculado no passo 3.4.
OBSERVAÇÃO: A matriz permanece na forma líquida apenas a 4 °C; Mantenha os tubos de estoque da matriz e as soluções da matriz-célula no gelo o tempo todo.
4. Cúpulas de matriz de revestimento e aplicação de mídia
- Misture a solução matriz-célula com uma pipeta P200 para distribuir uniformemente as células sem introduzir bolhas. Remova a placa de cultura de 6 poços da incubadora a 55 ° C.
- Pipete cuidadosamente 200 μL de solução de célula matriz e coloque rapidamente a solução em um poço para criar cúpulas.
- Repetir o passo 4.2 até esgotar o volume da solução matriz-célula. Deixe as cúpulas solidificarem em temperatura ambiente por 2 min.
- Vire o prato de 6 poços de cabeça para baixo e coloque-o em uma incubadora a 37 ° C para continuar a solidificação por 20 min.
- Após a incubação, adicione 2 mL de meio organoide de próstata de camundongo a cada poço. Adicione o andrógeno sintético R1881 a cada poço para uma concentração final de 1 nM e o inibidor de rocha Y-27632 a uma concentração final de 10 μM. Misture cuidadosamente e coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C para cultura.
OBSERVAÇÃO: Os meios de cultura organoides precisam ser suplementados com 10 μM de inibidor de rocha Y-27632 por apenas 1 semana após a geração do organoide.
