Perfusão hepática murina in vivo: um método para infundir o fígado de roedor com solução através da veia porta

Resumo

Fonte: Cabral, F., et al. Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais da perfusão hepática de camundongos. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve um procedimento para perfusão hepática de camundongo através da veia porta usando solução de colagenase antes de isolar as células hepáticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação

1. Preparação de soluções e meios de cultura
   1. Prepare todos os meios de cultura e tampão de acordo com a Tabela de Materiais.
2. Preparação de instrumentos
   1. Montar um banho-maria (>10 l) a 42 °C, uma bomba peristáltica com velocidade variável e pinças para segurar os frascos. Prepare tesouras e pinças curvas (Figura 1).
   2. Sobre ou adjacente ao banho-maria, coloque uma assadeira (cerca de 38 x 26 cm) com uma almofada de isopor (rack cônico de 50 mL), revestida com uma almofada absorvente cortada em um pedaço de 20 x 20 cm (Figura 1).
   3. Coloque um pedaço de fita adesiva (5–8 cm) por perto. Coloque uma linha de costura de poliéster de 20 cm por perto, cortada e pronta para uso. Obtenha um cateter plástico com agulha retrátil (7 mm x 19 mm, Figura 1).
3. Preparação de vidraria
   1. Usando pinças, coloque e imobilize um frasco de 1 L no banho-maria contendo 200 mL de 1x PBS com uma rolha que tenha duas pipetas de 1 mL entrando na solução. A cortiça de borracha é entalhada para permitir a recirculação do fluido em circuito fechado.
   2. Com outra pinça, coloque um frasco de 125 mL contendo 45 mL de tampão 2 junto com uma rolha que tenha duas pipetas de 1 mL, uma das quais está no líquido próximo ao fundo do frasco e a outra que fica acima do líquido e sopra oxigênio no frasco.
      nota: Cada pipeta nas rolhas terá um adaptador de desconexão rápida conectado à extremidade para facilitar a troca da tubulação. O oxigênio fluirá suavemente para ambos os frascos através da pipeta na rolha que não está imersa no líquido.
   3. Reserve dois pratos de cristalização estéreis.

2. Procedimento Animal

1. Aqueça as soluções de PBS e Buffer 2 a 42 °C no banho-maria e circule PBS por pelo menos 20 mL / min na tubulação em um circuito fechado para manter as linhas de líquido aquecidas. Mergulhe o excesso de tubo no banho-maria para permanecer o mais próximo possível de 42 °C. Drene a extremidade macho do tubo para o balão de 1 L contendo PBS.
2. Coloque uma bola de algodão na almofada absorvente e adicione cerca de 2 mL de isoflurano a 30% (composto em polietilenoglicol 200 que diminui a taxa de evaporação do isoflurano) na bola de algodão usando uma pipeta de transferência.
3. Pegue o rato pela cauda, coloque-o em um dos pratos de cristalização e, em seguida, vire rapidamente o prato sobre a bola de algodão para que o rato tenha um pequeno espaço para inalar a anestesia. Observe a frequência respiratória do mouse e certifique-se de que ele esteja efetivamente sob anestesia.
   nota: A frequência respiratória deve ser mais lenta e profunda, a cauda flácida e as patas não respondem ao teste de pinça sob anestesia; consulte as diretrizes da IACUC para obter detalhes adicionais.
4. Enquanto o camundongo está sob anestesia (isso leva de 1 a 2 minutos), prepare o cilindro de uma seringa de 10 mL puxando o êmbolo e inserindo uma pequena bola de algodão. Adicione 1-2 mL de isoflurano a 30% com uma pipeta de transferência à bola de algodão dentro do barril e coloque o cano aberto sobre uma mesa enquanto espera que o camundongo fique inconsciente.
5. Retire rapidamente o prato de cristalização, vire o mouse de costas e coloque o corpo da seringa sobre o nariz. Verifique novamente a taxa de respiração, beliscar o dedo do pé e a cauda flácida. Quaisquer respostas ao beliscão do dedo do pé e à cauda flácida indicam que o camundongo não está totalmente sob anestesia. Mantenha o corpo da seringa sobre o focinho para manter a inconsciência.
6. Coloque tachinhas nas patas do rato, com os membros estendidos em decúbito dorsal. Molhe o abdômen e a caixa torácica com isopropanol ou etanol a 70%.
7. Com a pinça reta em uma mão, levante a pele perto da base do abdômen. Com uma tesoura na outra mão, corte a pele e o peritônio da tenda. A incisão deve ser horizontal ou transversal à base da pele em tenda. Certifique-se de cortar todas as camadas da pele e do peritônio para obter acesso ao intestino. Corte lateralmente ao redor do abdômen até a caixa torácica em ambos os lados sem cortar nenhum dos órgãos.
8. Corte a aba da pele cortando a caixa torácica inferior. Mova os intestinos para a direita com a parte de trás da pinça para expor a veia porta.
   nota: O sangramento do animal deve ser mínimo; O animal ainda deve estar respirando e sob anestesia profunda.
9. Coloque a pinça curva fechada sob a veia porta entre o fígado e a veia pancreaticoduodenal superior (Figura 2 seta).
10. Abra a pinça enquanto estiver embaixo da veia porta. Segure o fio e puxe-o com cuidado para que fique centralizado sob a veia porta. Dê um nó ao redor da veia porta sem apertá-la.
11. Coloque a pinça curva sob a veia porta e puxe-a suavemente em direção à cauda do mouse para endireitar a veia (Figura 3A).
12. Com o cateter na outra mão, coloque o chanfro da agulha voltado para cima e paralelo à parte inferior da veia porta próximo à pinça (Figura 3B).
13. Perfure suavemente a veia com a agulha (Figura 3C). Certifique-se de que o bisel da agulha está no lúmen da veia. Retraia a agulha com mola e continue a empurrar o cateter de polímero através da veia até que o chanfro esteja próximo à área venosa ramificada. Isso está dentro do fígado. Se o cateter for colocado corretamente, um refluxo de sangue será visível. (Figura 3D).
14. Aperte o nó overhand e puxe-o para baixo no cateter para ajudar a estabilizá-lo. Diminua imediatamente a taxa da bomba de 20 mL / min para 4 mL / min e corte outro vaso sanguíneo importante para drenagem. Corte a aorta abdominal para obter os melhores resultados.
15. Coloque a extremidade macho do tubo na extremidade fêmea do cateter (Figura 4A). Certifique-se de que não haja bolhas de ar na linha. Tenha cuidado para que o cateter não seja empurrado para dentro do fígado ou para fora da veia. A colocação do fio não é essencial, embora ajude a evitar o refluxo para fora da veia e ajude a manter o cateter na posição correta (Figura 4B, C).
16. Use fita adesiva para imobilizar o tubo na almofada. Use a pinça reta para espremer o vaso sanguíneo efluente para inflar o fígado algumas vezes para garantir que todo o sangue tenha sido drenado (Figura 4D).
    nota: A fita de laboratório padrão pode não funcionar; no entanto, a fita adesiva permanecerá presa ao resguardo, mesmo em condições úmidas.

3. Perfusão Hepática

1. Enquanto o fígado está lavando com PBS, meça cerca de 24 mg de colagenase tipo IV e coloque-o no frasco contendo 45 mL de tampão 2 no banho-maria. Certifique-se de agitar o líquido no frasco para que a colagenase seja totalmente dissolvida e coloque o frasco de volta no clamp para que o líquido contendo a parte do frasco fique totalmente submerso na água.
2. Observe a mudança na cor do fígado à medida que ele é lavado com PBS. Troque o tubo de saída do balão de 1 L para o balão de 125 ml. Não permita que bolhas de ar fluam para o fígado.
3. Assim que o tampão de perfusão atingir o fígado, aperte brevemente o vaso sanguíneo efluente para aumentar a pressão dentro do vaso e permitir que esse líquido preencha todos os lobos do fígado. Certifique-se de não interromper a drenagem por muito tempo, pois isso pode estourar o fino tecido conjuntivo ao redor do fígado (cápsula de Glisson) e destruir a perfusão ou o fluxo de líquido dentro do leito capilar do fígado.
4. Permita que o tampão 2 com colagenase se perfunda no fígado até que todos os 45 mL tenham fluído pelo tecido.
   nota: Se for bem-sucedida, a cápsula de Glisson deve ser separada do parênquima ou do tecido hepático e o próprio fígado deve parecer amorfo.
5. Adicione cerca de 10 mL de tampão 1 ao outro prato cristalizador e coloque-o ao lado do mouse.
6. Remova o cateter e desligue a bomba.
7. Com a pinça reta e a tesoura, corte o fígado do camundongo. Se a digestão da colagenase foi muito eficiente, pode ser necessário ter uma colher limpa e estéril à mão para retirar o fígado do camundongo e colocá-lo no tampão 1.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática da suíte de perfusão. Os frascos são mantidos no lugar por grampos (não mostrados); a tubulação contendo fluido é trocada do frasco de 1L para o frasco de 125 mL durante o procedimento é representada pela linha pontilhada vermelha. Observe que a alimentação de oxigênio não borbulha diretamente nas soluções nos frascos. As rolhas também devem ser ent...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Erlenmeyer de 1 L	Fisher Científico	S63274
Balão Erlenmeyer de 250 ml	Fisher Científico	S63271
Tubos de silicone	Cole-Parmer	Rolamento 96400-14	Este tubo vai dos frascos através da bomba até o conector T e, em seguida, para a seringa de 1,0 mL que é conectada ao cateter.
Tubulação Tygon	Fisher Científico	R3603	Usado como um adaptador entre 96400-14 e pipetas e conector T. Isso também pode ser usado para a tubulação de oxigênio.
Conectores em T	Cole-Parmer	EW-06294-82
Desconexões rápidas	Fisher Científico	Nº 6150-0010
Grampos de aperto	Fisher Científico	Nº 6165-0002
Bomba de velocidade variável Masterflex L/S; modelo 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Bomba periplástica com velocidade variável
Cabeça da bomba; modelo 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
Pipetas de 1,0 mL graduadas em vidro	Fisher Científico	13-678
Tesoura curva não serrilhada	Ferramentas de Belas Ciências	14069-12
Pinça Dumont	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20
Pinça curva	Ferramentas de Belas Ciências	13009-12
Seringa de 10 mL	Fisher Científico	03-377-23	Apenas o barril da seringa será necessário
Colher esterilizada	Loja de material doméstico
Bola(s) de algodão	Loja de material doméstico
Linha de costura de poliéster	Loja de material doméstico
Fita adesiva	Loja de material doméstico
Tachinhas	Loja de material doméstico
Almofada de isopor	Rack cônico de 50 mL
Biscoito/assadeira	Loja de material doméstico
Almofadas absorventes	Fisher Científico	14-206-64
Banho-maria de 19 L	Fisher Científico	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Blindado IV Cateter 24 calibre	Becton Dickinson	381412	Catetar de plástico com agulha retrátil
Pratos cristalizadores 100x50	VWR	89000-290
Placas de Petri de poliestireno	Sigma Aldrich	Pág. P5481-500EA
Tubos cônicos de 50 mL	Fisher Científico	12-565-270
Pipetas graduadas (5 mL)	Fisher Científico	170355
Pipetas graduadas (25 mL)	Fisher Científico	170357
Filtro EasyStrainer 100 μM	Greiner bio-one	Rolamento 542000	Filtro de 100 μm
Filtro EasyStrainer 40 μM	Greiner bio-one	Rolamento 542040	Filtro de 40 μm
Reagentes
nome	composto	Gramas (g/L)	Milimolar (mM)
Tampão 1; pH 7,4	NaCl	8.3	142
	Kcl	0,5	6.7
	HEPES	2.4	10
	Bsa	15	0,226
Tampão 2; pH 7,4	NaCl	3.9	66,74
	Kcl	0,5	6.71
	CaCl2	0,7	6.31
	HEPES	24	100
	Bsa	15	0,226
	Vermelho de fenol	0,01	0,03
PBS; pH 7,4	NaCl	8	137
Kcl	0,2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0,2	1.4
OUTROS REAGENTES
nome	companhia	Número de catálogo	Comentários
Colagenase Tipo IV	Sigma Aldrich	C5138
Isoflurano	Abcam	AB144581