Ensaio de spin down de agarose: uma técnica para incorporar organoides para análise histológica

Resumo

Fonte: Lee, S. et al. Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) Derivados de Amostras de Metástase Óssea de Câncer de Próstata de Pacientes e seus Xenoenxertos. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, realizamos um ensaio spin-down para incorporar organoides 3D de câncer de próstata em agarose. Esses organoides incorporados podem ser usados para análises histopatológicas adicionais para estudar o crescimento e o desenvolvimento do câncer.

Protocolo

1. Processamento de organoides para histologia: o método de rotação de agarose

NOTA: Este protocolo é adaptado de uma publicação anterior de Vlachogiannis et al. Adicionamos uma etapa envolvendo a incorporação de agarose para incorporar todas as populações de organoides com sucesso.

1. Remova a mídia existente do poço. Tenha cuidado para não aspirar as cúpulas da membrana basal.
2. Adicionar um volume igual (igual ao volume do meio removido da etapa 1) da solução de recuperação celular e incubar durante 60 min a 4 °C.
3. Desaloje a cúpula da membrana basal usando uma pipeta e esmague a cúpula da membrana basal usando uma ponta de pipeta. Colete a solução dissociada de cúpula e recuperação celular em um tubo de 1,5 mL.
4. Centrifugue a 300 x g e 4 °C por 5 min.
5. Remova o sobrenadante (solução de recuperação celular). Guarde todos os sobrenadantes em tubos separados até o final, quando a presença de organoides for confirmada na etapa final de peletização.
6. Adicione o volume desejado (Tabela 1) de PBS frio e pipete suavemente para cima e para baixo para perturbar o pellet mecanicamente.
7. Centrifugue a 300 x g e 4 °C por 5 min.
8. Remova o sobrenadante (PBS).
9. Fixe o pellet em um volume correspondente (por exemplo, 500 μL para um pellet da condição de cultura em placas de 24 poços, Tabela 1) de 4% de PFA por 60 min à temperatura ambiente.
10. Após a fixação, centrifugue a 300 x g e 4 °C por 5 min.
11. Remova o sobrenadante (PFA).
12. Lave com o volume correspondente (por exemplo, 500 μL para um pellet da condição de cultura em placas de 24 poços, Tabela 1) de PBS e centrifugue a 300 x g e 4 °C por 5 min.
13. Prepare agarose quente (2% de agarose em PBS).
    nota: Aqui, os pellets de células para seções congeladas podem ser ressuspensos diretamente em 200 μL de composto OCT.
14. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de agarose (2% em PBS).
    1. Imediatamente após a adição de agarose, retire suavemente o pellet celular da parede do tubo de 1,5 mL usando a agulha de 25 G conectada à seringa de 1 mL. Conforme mostrado na Figura 1, se o pellet celular não estiver fisicamente separado da parede do tubo de 1,5 mL, existe o risco de perder todo ou parte do pellet celular durante o processo de inclusão de agarose.
15. Espere até que a agarose a 2% no PBS esteja completamente solidificada.
16. Retire o bloco de agarose solidificado do tubo de 1,5 ml utilizando uma agulha de 25 G ligada à seringa de 1 ml.
17. Transfira o bloco de agarose destacado contendo o pellet celular para um novo tubo de 1,5 ml.
18. Encha o tubo com 70% de EtOH e prossiga usando o protocolo convencional para desidratação de tecidos e inclusão de parafina.

Tabela 1: Densidade de semeadura, volume da membrana basal e volume médio necessário para uma cúpula

Placa de cultura	Densidade de semeadura (células)	Volume da membrana basal (μL)	Meio (μL)
48 poço	25.000-50.000	20	250
24 poços	50.000-250.000	40	500
6 poço	50.000-250.000	40	2.000

Resultados

Figura 1: Um passo fundamental para uma incorporação bem-sucedida de agarose. Um processo para separar o pellet celular da parede do tubo de 1,5 mL.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL de Pipettman	Gilson	F123602
Seringa de 1 mL	Seringa BD	329654
Tubo de 1,5 mL	Produtos Spectrum Lab	941-11326-ATP083
Agulha 25G	Agulha BD PrecisionGlide	305122
Paraformaldeído a 4% (PFA)	Alfa Aesar	J61899
Etanol 70% (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
agarose	Lonza	50000
Placa de Cultura de Células - 24 poços	Costar	3524
Placa de Cultura de Células - 48 poços	Costar	3548
Placa de Cultura de Células - 6 poços	Costar	3516
Solução de dissociação celular, Accumax	Tecnologias Celulares Inovadoras, Inc.	AM105
Solução de recuperação celular	Corning	354253
Raspador de células	Sarstedt	83.18
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
Ponteiras de pipeta para 1 mL (ponteiras azuis)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Centrífuga de mesa pequena	ThermoFisher Scientific	75002426
Composto OCT	Tecido-Tek	Nº 4583
Banho-maria	Fisher Sc	2320