1. Plaqueamento de células epiteliais da próstata classificadas em cultura organoide primária de camundongo - TEMPO: 2-3 H (excluindo preparação de placa revestida com poli-HEMA)
NOTA: As placas são revestidas com Poly-HEMA para evitar a formação de colônias 2D na superfície do poço abaixo do gel da matriz. Prepare placas revestidas com Poly-HEMA 1 dia antes do plaqueamento das células epiteliais basais ou luminais da próstata classificadas em cultura organoide de camundongo. Descongelar alíquotas de 1 ml de gel de matriz de factor de crescimento reduzido, a seguir designado por gel de matriz, em gelo 2 h antes do passo 1.1. Y-27632 (inibidor de ROCK) deve ser adicionado ao meio organoide do camundongo imediatamente antes da etapa 1.1. Execute as etapas 1.1-1.8 no gelo.
- Pulverizar as células em tubos de fundo redondo de 5 ml por centrifugação a 800 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
- Lave o pellet celular em 500 μL de meio organoide de camundongo (Tabela 1).
- Pulverizar as células por centrifugação a 800 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspenda em meio organoide de camundongo com uma densidade celular de 1.000 células / μL.
- Para preparar misturas principais, misture células epiteliais suspensas em meio organoide de camundongo com gel de matriz para gerar uma mistura final que contenha 25% de células/meio e 75% de gel de matriz. As células basais são tipicamente plaqueadas a uma concentração de 100-2.000 células/80 μL, enquanto as células luminais são tipicamente plaqueadas a uma concentração de 2.000-10.000 células/80 μL. A densidade das células revestidas varia dependendo do dia da coleta de material prevista e da aplicação desejada a jusante.
NOTA: Resfrie o(s) tubo(s) de tamanho apropriado para o volume esperado da mixagem principal 5 minutos antes da preparação da mixagem principal. Para garantir que o gel da matriz não endureça durante o manuseio, é fundamental resfriar a ponta da pipeta pipetando o gel da matriz 3-4 vezes antes de transferi-lo para um novo tubo.
- Adicione 80 μL da mistura gel/célula da matriz por alvéolo de uma placa de 24 poços. Pipetagem uma gota na metade inferior da parede do poço, evitando o contato direto com o revestimento Poly-HEMA, é recomendado. Depois de adicionar o gel de matriz, gire a placa para permitir que a mistura de gel/célula de matriz forme um anel ao redor da borda do poço.
- Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de 37 °C 5% CO2 com o lado direito para cima por 10 min para permitir que o gel da matriz endureça parcialmente.
NOTA: Comece a aquecer o meio organoide do camundongo a 37 ° C imediatamente após colocar a placa de 24 poços na incubadora.
- Depois de incubar por 10 min, vire a placa de 24 poços de cabeça para baixo e incube por mais 50 min para permitir que o gel da matriz endureça completamente.
- Adicione 350 μL de mídia organoide de camundongo pré-aquecida gota a gota no centro de cada poço.
NOTA: Para manter a integridade do gel da matriz, é fundamental evitar o anel de gel da matriz ao adicionar mídia.
- Depois de adicionar o meio, retorne a placa de 24 poços para a incubadora de 37 °C 5% CO2.
2. Reabastecimento de mídia organoide de mouse — TEMPO: 10-15 min por placa de 24 poços
NOTA: A mídia existente deve ser substituída por uma nova mídia a cada 48 h. Antes de cada mudança de mídia, pré-aqueça a mídia organoide do mouse. Não é necessário adicionar inibidor de ROCK ao meio usado para reposição.
- Incline a placa de 24 poços em um ângulo de 45° e remova suavemente o meio existente do centro de cada poço usando uma pipeta P1000, evitando o anel de gel da matriz.
- Adicione 350 μL de mídia organoide de camundongo pré-aquecida como na etapa 1.9. Recomenda-se adicionar um volume maior de meio (até 1 mL) aos organoides cultivados por mais de 5 dias para evitar o rápido esgotamento dos principais nutrientes e fatores de crescimento.
Tabela 1: Instruções para a preparação de meios organoides de camundongo
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componente
| concentração
|
| B-27 | 1x (diluir de 50x concentrado) |
| GlutaMAX | 1x (diluir a partir de 100x concentrado) |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| EGF Humano Recombinante, Livre de Animais | 50 ng/mL |
| Cabeça Humana Recombinante | 100 ng/mL |
| Meio condicionado R-spondin 1 | 10% de mídia condicionada |
| A83-01 | 200 nM |
| DHT | 1 nM |
| Cloridrato de Y-27632 (inibidor de ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avançado | Mídia base |
| R-spondin 1-mídia condicionada é gerada conforme descrito em Drost et al. Após a adição de todos os componentes, filtre e esterilize os meios organoides do camundongo usando um filtro de 0,22 μm. O inibidor de ROCK é adicionado apenas durante o estabelecimento da cultura e a passagem de organoides. |
