Extração de lisado de proteína: uma técnica para lisar organoides para coletar proteínas celulares

1. Extraindo lisado de proteína de organoides de próstata para análise de Western Blot - TEMPO: 2,5-4 H

NOTA: Antes de coletar organoides para extração de lisado de proteína, prepare e pré-aqueça o meio contendo dispase (Tabela 1).

1. Remova o meio de cada poço inclinando a placa de 24 poços em um ângulo de 45° e removendo suavemente o meio existente do centro de cada poço usando uma pipeta P1000, evitando o anel de gel da matriz.
2. Para coletar organoides, jatee repetidamente o gel da matriz pipetando 1 mL de meio contendo dispase diretamente no anel de gel da matriz até que todo o anel seja desalojado e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: É fundamental evitar o contato direto com os poços revestidos com Poly-HEMA. O contato direto pode causar contaminação do material coletado com Poly-HEMA, o que pode impactar negativamente a sobrevivência celular.
3. Coloque o(s) tubo(s) de microcentrífuga de 1,5 mL em uma incubadora de CO₃₇ a 37 °C 5% 2 por 30 min a 1 h para permitir a digestão completa do gel da matriz por dispase.
4. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 5 min a RT e remover o sobrenadante com uma micropipeta.
5. Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao pellet organoide e ressuspenda sacudindo suavemente.
   NOTA: A falha em ressuspender suficientemente o pellet organoide pode resultar na contaminação do material organoide com dispase residual ou gel de matriz.
6. Pelete os organoides por centrifugação a 800 x g durante 5 min a RT e remova o sobrenadante utilizando uma micropipeta.
7. Congele rapidamente os grânulos organoides colocando cada tubo em uma solução contendo gelo seco e metanol. Conservar o(s) tubo(s) até utilização futura a -80 °C. Em alternativa, extrair o lisado de proteínas imediatamente após o passo 1.6.
8. Ressuspenda os grânulos organoides em 100 μL de tampão de lise de proteína (Tabela 1) por 10 μL de volume de células compactadas. Deslize para ressuspender.
   NOTA: Se retomar após o congelamento rápido, certifique-se de que o tampão de lise de proteína esteja descongelado antes de remover as amostras de -80 °C, pois o tampão de lise deve ser adicionado às amostras imediatamente para evitar a atividade da fosfatase e da protease.
9. Incube as amostras em tampão de lise de proteína em gelo por pelo menos 45 min.
   NOTA: Recomenda-se sonicar antes da incubação em gelo para aumentar a eficiência da recuperação de proteínas nucleares; no entanto, a sonicação não é necessária. Se a sonicação não for realizada, prossiga para a etapa 1.10.
   1. Para sonicar, mergulhe os tubos em gelo úmido e aplique suavemente a ponta do desmagnetizador sônico no tubo da microcentrífuga. Sonicar por 40 s a 20 kHz.
10. Prossiga para Western blot seguindo os protocolos estabelecidos.

Tabela 1: Instruções para a preparação de soluções-chave