Extração de lisado de proteína: uma técnica para lisar organoides para coletar proteínas celulares

Resumo

Fonte: Crowell, P. D. et al. Avaliando a capacidade de diferenciação de células epiteliais da próstata de camundongo usando cultura organoide. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos a extração de lisados de proteínas de organoides de próstata cultivados em um anel de matriz de membrana basal. A análise das frações proteicas extraídas pode ajudar a estudar a expressão do marcador de linhagem nos organoides.

Protocolo

1. Extraindo lisado de proteína de organoides de próstata para análise de Western Blot - TEMPO: 2,5-4 H

NOTA: Antes de coletar organoides para extração de lisado de proteína, prepare e pré-aqueça o meio contendo dispase (Tabela 1).

1. Remova o meio de cada poço inclinando a placa de 24 poços em um ângulo de 45° e removendo suavemente o meio existente do centro de cada poço usando uma pipeta P1000, evitando o anel de gel da matriz.
2. Para coletar organoides, jatee repetidamente o gel da matriz pipetando 1 mL de meio contendo dispase diretamente no anel de gel da matriz até que todo o anel seja desalojado e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: É fundamental evitar o contato direto com os poços revestidos com Poly-HEMA. O contato direto pode causar contaminação do material coletado com Poly-HEMA, o que pode impactar negativamente a sobrevivência celular.
3. Coloque o(s) tubo(s) de microcentrífuga de 1,5 mL em uma incubadora de CO₃₇ a 37 °C 5% 2 por 30 min a 1 h para permitir a digestão completa do gel da matriz por dispase.
4. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 5 min a RT e remover o sobrenadante com uma micropipeta.
5. Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao pellet organoide e ressuspenda sacudindo suavemente.
   NOTA: A falha em ressuspender suficientemente o pellet organoide pode resultar na contaminação do material organoide com dispase residual ou gel de matriz.
6. Pelete os organoides por centrifugação a 800 x g durante 5 min a RT e remova o sobrenadante utilizando uma micropipeta.
7. Congele rapidamente os grânulos organoides colocando cada tubo em uma solução contendo gelo seco e metanol. Conservar o(s) tubo(s) até utilização futura a -80 °C. Em alternativa, extrair o lisado de proteínas imediatamente após o passo 1.6.
8. Ressuspenda os grânulos organoides em 100 μL de tampão de lise de proteína (Tabela 1) por 10 μL de volume de células compactadas. Deslize para ressuspender.
   NOTA: Se retomar após o congelamento rápido, certifique-se de que o tampão de lise de proteína esteja descongelado antes de remover as amostras de -80 °C, pois o tampão de lise deve ser adicionado às amostras imediatamente para evitar a atividade da fosfatase e da protease.
9. Incube as amostras em tampão de lise de proteína em gelo por pelo menos 45 min.
   NOTA: Recomenda-se sonicar antes da incubação em gelo para aumentar a eficiência da recuperação de proteínas nucleares; no entanto, a sonicação não é necessária. Se a sonicação não for realizada, prossiga para a etapa 1.10.
   1. Para sonicar, mergulhe os tubos em gelo úmido e aplique suavemente a ponta do desmagnetizador sônico no tubo da microcentrífuga. Sonicar por 40 s a 20 kHz.
10. Prossiga para Western blot seguindo os protocolos estabelecidos.

Tabela 1: Instruções para a preparação de soluções-chave

Receitas
Mídia contendo dispase	1 mg/mL de dispase + 10 μM de inibidor de ROCK em DMEM F12 avançado. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
Meios de dissociação	10% FBS + 1x Penicilina-Estreptomicina em RPMI 1640. Esterilize o filtro usando um filtro de 0,22 μm.
Tampão de lise de proteína	Tampão RIPA + inibidores de fosfatase + inibidores de protease
Solução de bloqueio	10% FBS em PBS com 0,2% Triton X-100

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
A83-01	Tocris	Nº 2939
DMEM/F-12 avançado	Thermo Fisher Científico	12634010
Suplemento B-27 (50x), Sem Soro	Thermo Fisher Científico	17504044
Dispase II, Pó	Thermo Fisher Científico	17-105-041
Soro fetal bovino (FBS)	sigma	Rolamento F8667
Garrafa térmica GlutaMAX	Fisher Científico	35050061
Inibidor de fosfatase de parada	Thermo Fisher Científico	Nº 78428
Matriz de membrana Matrigel GFR	Corning CB-	40230C
N-acetil-L-cisteína	sigma	Rolamento A9165
Normocin	Thermo Fisher Científico	formiga-nr-1
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ mL)	Thermo Fisher Científico	15-140-122
Poli(2-hidroxietil metacrilato) (Poli-HEMA)	sigma	Pág. 3932-25G
Ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)	Thermo Fisher Científico	PI89901
EGF Humano Recombinante, AnimalFree	PeproTech	AF-100-15
Cabeça Humana Recombinante	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Médio, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Científico	22400105
Desmembrador Sônico	Thermo Fisher Científico	FB120
Tritão X-100	sigma	X100-5ML
Cloridrato de Y-27632 (inibidor de ROCK)	Selleck Química	S1049-50MG