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1. Fixação e Coloração de Organoides da Próstata para Análise Imuno-Histoquímica por Microscopia Confocal de Montagem Inteira
- Coleta de organoides de próstata de placas de 24 poços — TEMPO: 45-60 min
NOTA: Ao coletar organoides de próstata para processar para microscopia confocal, é fundamental manuseá-los com cuidado para manter sua estrutura. O protocolo de coleta abaixo é projetado para reduzir a ruptura da estrutura organoide durante o isolamento.
- Remova a mídia de cada poço da placa contendo organoides inclinando a placa em um ângulo de 45°.
- Digerir o gel da matriz incubando-o com 500 μL de meios contendo dispase (Tabela 1) durante 30 min numa incubadora de CO2 a 37 °C a 5%.
- Coletar a suspensão organoide digerida em um tubo de microcentrífuga e granular os organoides por centrifugação a 800 x g por 3 min em RT. Remover o sobrenadante.
- Coloração imunofluorescente total de organoides da próstata — TEMPO: 3-4 dias (1-5 h/dia)
- Adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS e incube por 2 h em RT com agitação suave.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min à RT, remover o sobrenadante e lavar o pellet com 1 ml de PBS durante 15 min com agitação suave.
- Lave o pellet como na etapa 1.2.2 por mais duas vezes.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicionar 1 μg/ml de DAPI na solução de bloqueio (Tabela 1). Incubar durante 2 h em temperatura alta ou, em alternativa, durante a noite a 4 °C, agitando suavemente.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicionar o anticorpo primário (anti-p63 de coelho, anticitoqueratina 8 de ratinho) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Lave o pellet com 1 mL de PBS por 15 min com agitação suave.
- Lave o pellet como na etapa 1.2.6 por mais duas vezes.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicione o anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-Alexa Fluor 594, cabra anti-camundongo IgG-Alexa Fluor 488) na solução de bloqueio e incube durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min à RT, remover o sobrenadante e lavar o pellet com 1 ml de PBS durante 15 min com agitação suave.
- Lave o pellet como na etapa 1.2.9 por mais duas vezes.
2. Limpeza de tecido e montagem dos organoides de próstata corados para microscopia confocal de montagem total - TEMPO: 7 H
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de sacarose a 30% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de sacarose a 45% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
- Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de sacarose a 60% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
- Pelotizar os organoides por centrifugação a 800 x g por 3 min em RT e remover 95% do sobrenadante.
NOTA: O pellet fica mais solto à medida que a concentração de sacarose aumenta. Recomenda-se observar os organoides corados com DAPI sob a luz ultravioleta para confirmar que eles não foram perdidos durante a remoção do sobrenadante.
- Transfira uma gota de 10-20 μL da suspensão restante para uma lamínula com câmara e prossiga para microscopia confocal.
NOTA: Os fragmentos de lamínula podem ser colocados em ambos os lados da gota para serem usados como espaçadores (Figura 1C). Isso evita que os organoides entrem em colapso quando uma lamínula é colocada sobre a gota.
Tabela 1: Instruções para a preparação de soluções-chave
| componente | concentração |
| B-27 | 1x (diluir de 50x concentrado) |
| GlutaMAX | 1x (diluir a partir de 100x concentrado) |
| N-acetil-L-cisteína | 1,25 mM |
| Normocin | 50 μg/mL |
| EGF Humano Recombinante, Livre de Animais | 50 ng/mL |
| Cabeça Humana Recombinante | 100 ng/mL |
| Meio condicionado R-spondin 1 | 10% de mídia condicionada |
| A83-01 | 200 nM |
| DHT | 1 nM |
| Cloridrato de Y-27632 (inibidor de ROCK) | 10 μM |
| DMEM/F-12 avançado | Mídia base |
| R-spondin 1-mídia condicionada é gerada conforme descrito em Drost, et al. Após a adição de todos os componentes, filtre e esterilize os meios organoides do camundongo usando um filtro de 0,22 μm. O inibidor de ROCK é adicionado apenas durante o estabelecimento da cultura e a passagem de organoides. |
