Imagem de imunofluorescência de montagem total: uma técnica de fixação e coloração para avaliar organoides intactos

Resumo

Fonte: Crowell, P. D. et al. Avaliando a capacidade de diferenciação de células epiteliais da próstata de camundongo usando cultura organoide. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica de coloração imunofluorescente de organoides intactos de câncer de próstata e sua imagem por microscopia confocal de montagem total. Esta técnica tem como objetivo avaliar a capacidade de diferenciação ex vivo de células epiteliais basais e luminais da próstata.

Protocolo

1. Fixação e Coloração de Organoides da Próstata para Análise Imuno-Histoquímica por Microscopia Confocal de Montagem Inteira

1. Coleta de organoides de próstata de placas de 24 poços — TEMPO: 45-60 min
   NOTA: Ao coletar organoides de próstata para processar para microscopia confocal, é fundamental manuseá-los com cuidado para manter sua estrutura. O protocolo de coleta abaixo é projetado para reduzir a ruptura da estrutura organoide durante o isolamento.
   1. Remova a mídia de cada poço da placa contendo organoides inclinando a placa em um ângulo de 45°.
   2. Digerir o gel da matriz incubando-o com 500 μL de meios contendo dispase (Tabela 1) durante 30 min numa incubadora de CO₂ a 37 °C a 5%.
   3. Coletar a suspensão organoide digerida em um tubo de microcentrífuga e granular os organoides por centrifugação a 800 x g por 3 min em RT. Remover o sobrenadante.
2. Coloração imunofluorescente total de organoides da próstata — TEMPO: 3-4 dias (1-5 h/dia)
   1. Adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS e incube por 2 h em RT com agitação suave.
   2. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min à RT, remover o sobrenadante e lavar o pellet com 1 ml de PBS durante 15 min com agitação suave.
   3. Lave o pellet como na etapa 1.2.2 por mais duas vezes.
   4. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicionar 1 μg/ml de DAPI na solução de bloqueio (Tabela 1). Incubar durante 2 h em temperatura alta ou, em alternativa, durante a noite a 4 °C, agitando suavemente.
   5. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicionar o anticorpo primário (anti-p63 de coelho, anticitoqueratina 8 de ratinho) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave.
   6. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Lave o pellet com 1 mL de PBS por 15 min com agitação suave.
   7. Lave o pellet como na etapa 1.2.6 por mais duas vezes.
   8. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante. Adicione o anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-Alexa Fluor 594, cabra anti-camundongo IgG-Alexa Fluor 488) na solução de bloqueio e incube durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
   9. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min à RT, remover o sobrenadante e lavar o pellet com 1 ml de PBS durante 15 min com agitação suave.
   10. Lave o pellet como na etapa 1.2.9 por mais duas vezes.

2. Limpeza de tecido e montagem dos organoides de próstata corados para microscopia confocal de montagem total - TEMPO: 7 H

1. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
2. Adicione 1 mL de sacarose a 30% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
3. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
4. Adicione 1 mL de sacarose a 45% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
5. Pulverizar os organoides por centrifugação a 800 x g durante 3 min a RT e remover o sobrenadante.
6. Adicione 1 mL de sacarose a 60% em PBS com Triton X-100 a 1% e incube por 2 h em RT com agitação suave.
7. Pelotizar os organoides por centrifugação a 800 x g por 3 min em RT e remover 95% do sobrenadante.
   NOTA: O pellet fica mais solto à medida que a concentração de sacarose aumenta. Recomenda-se observar os organoides corados com DAPI sob a luz ultravioleta para confirmar que eles não foram perdidos durante a remoção do sobrenadante.
8. Transfira uma gota de 10-20 μL da suspensão restante para uma lamínula com câmara e prossiga para microscopia confocal.
   NOTA: Os fragmentos de lamínula podem ser colocados em ambos os lados da gota para serem usados como espaçadores (Figura 1C). Isso evita que os organoides entrem em colapso quando uma lamínula é colocada sobre a gota.

Tabela 1: Instruções para a preparação de soluções-chave

componente	concentração
B-27	1x (diluir de 50x concentrado)
GlutaMAX	1x (diluir a partir de 100x concentrado)
N-acetil-L-cisteína	1,25 mM
Normocin	50 μg/mL
EGF Humano Recombinante, Livre de Animais	50 ng/mL
Cabeça Humana Recombinante	100 ng/mL
Meio condicionado R-spondin 1	10% de mídia condicionada
A83-01	200 nM
DHT	1 nM
Cloridrato de Y-27632 (inibidor de ROCK)	10 μM
DMEM/F-12 avançado	Mídia base
R-spondin 1-mídia condicionada é gerada conforme descrito em Drost, et al. Após a adição de todos os componentes, filtre e esterilize os meios organoides do camundongo usando um filtro de 0,22 μm. O inibidor de ROCK é adicionado apenas durante o estabelecimento da cultura e a passagem de organoides.

Resultados

Figura 1: Análise da expressão do marcador de linhagem em organoides da próstata por Western blot e microscopia confocal de montagem total.(A) Imagens representativas de contraste de fase de organoides derivados basais (superior) e luminosos (inferiores) após 7 dias de cultura. Barra de escala = 100 μm. (B) Análise de Western blot de organoides derivados da base (Bas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% Paraformaldeído	Thermo Fisher Científico	Telefone: 50-980-487
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Científico	D1306
DMEM/F-12 avançado	Thermo Fisher Científico	12634010
Dispase II, Pó	Thermo Fisher Científico	17-105-041
Soro fetal bovino (FBS)	sigma	Rolamento F8667
IgG-Alexa Fluor 488 da anti-rato da cabra	Invitrogen	Rolamento A28175
Cabra anti-coelho IgG-Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012
Anticitoqueratina 8 de camundongo	BioLegend	904804
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Científico	15-140-122
Coelho anti-p63	BioLegend	619002
RPMI 1640 Médio, HEPES (cs de 10)	Thermo Fisher Científico	22400105
sacarose	sigma	S0389-500G
Tritão X-100	sigma	X100-5ML