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Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. A dissecção do sistema urogenital (UGS)
NOTA: O esquema é apresentado na Figura 1.
- Eutanasiar um camundongo C57BL/6 macho de 3 meses de idade usando o método de eutanásia inalatória CO2 ou outra técnica aprovada.
nota: Camundongos entre 3 e 12 meses de idade podem ser usados com sucesso para o experimento. Camundongos mais velhos (> 6 meses) provavelmente terão mais gordura ao redor do UGS, que precisará ser eliminado. A identificação e separação dos lobos é muitas vezes difícil em camundongos com menos de 3 meses. Outras cepas também podem ser usadas para o experimento.
- Coloque o rato de costas e prenda as pernas usando alfinetes para que o lado ventral do animal fique exposto.
- Borrife etanol 70% no abdômen do camundongo e limpe-o.
nota: Não é necessário raspar os pelos do abdômen antes da dissecção.
- Levante a pele do abdômen, junto com a camada muscular, com uma pinça média romba e faça uma incisão em forma de Y invertido no abdômen usando uma tesoura.
- Primeiro, faça uma incisão reta com uma tesoura afiada logo acima do pênis até o esterno (Figura 2a).
- Corte da base da incisão em direção a cada dedo do pé, até as coxas (Figura 2b). Dobre a pele para trás em ambos os lados e na parte inferior para visualizar toda a área abdominal (Figura 2c-e).
nota: O tamanho do corte varia de acordo com a idade e o tamanho do mouse. O tamanho da incisão reta inicial pode variar de 1,5 a 4 cm, dependendo do tamanho do mouse.
- Mova-se sobre os outros órgãos para expor o UGS. Levante e mova os intestinos marrom-amarelos (Figura 2f). Pegue as bolsas de gordura abdominal (o tecido esponjoso branco opaco) com uma pinça e mova-as para os lados (Figura 2g).
nota: A UGS compreende as vesículas seminais, uretra, próstata, ducto deferente (ducto deferente) e bexiga urinária. Pode ser identificado pelo par característico de arcos semicirculares brancos opacos (que são as vesículas seminais), com o saco vesical cheio de líquido preso à base. O tecido translúcido localizado logo abaixo das vesículas seminais é a próstata.
- Localize o UGS, segure firmemente a bexiga urinária com uma pinça romba e levante todo o UGS para cima do abdômen do camundongo.
nota: Se a bexiga estiver cheia, drene-a primeiro com uma seringa pequena para proporcionar uma melhor aderência com a pinça e reduzir o risco de ruptura da bexiga.
- Continuando a puxar a bexiga, deslize uma tesoura por baixo da bexiga e da próstata até a coluna e faça um corte. Corte todas as conexões restantes com a cavidade abdominal (Figura 2h e 2i). Tenha cuidado para não cortar muito perto do UGS para evitar cortes acidentais em qualquer tecido da próstata.
nota: Ao fazer o corte sob o UGS, a tesoura deve ser inserida até a parte de trás do mouse, para que o corte também encaixe a coluna vertebral. Este método resulta no corte de quase todas as conexões entre o UGS e a cavidade abdominal em um recorte, reduzindo o tempo necessário para extrair o tecido do camundongo.
- Remova o UGS e coloque-o em 2-6 mL (o suficiente para cobrir o tecido) de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta) em uma placa de Petri de 6 cm (Figura 2j e 2k) e mova-o para um microscópio de dissecção (aumento de 10X).
nota: Altere o meio de dissecação conforme necessário nas etapas restantes.
