Isolamento de células-alvo baseado em fio funcionalizado: uma técnica ex vivo para isolar células cancerígenas do sangue periférico enriquecido

NOTA: Este protocolo descreve o isolamento de células HT-29 (linha celular de câncer de cólon humano) de PBS ou de misturas artificiais de células HT-29 e sangue periférico. O mesmo experimento foi realizado com duas linhagens celulares adicionais (LNCaP e VCaP) e teoricamente pode ser realizado com todas as células que expressam EpCAM.

1. Preparação de células-alvo

1. Cultura celular e marcação de células
   nota: Neste protocolo, as células são cultivadas em frascos de cultura de 75 cm². Ajuste as quantidades de reagentes de acordo se outros dispositivos de cultura de células forem usados (por exemplo, placas de cultura de 25 cm², placas de 6 poços, etc.). Todos os líquidos utilizados são pré-aquecidos a 37 °C em banho-maria. Se não for indicado o contrário, todas as etapas do protocolo são executadas à temperatura ambiente (RT).
   1. Cultura de células HT-29 em meio modificado McCoy's 5a suplementado com 2 mM de L-glutamina, 20 mM de Hepes, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Quando as células estiverem 90% confluentes, remova o meio e enxágue as células com 10 mL de 1x PBS.
   3. Para colher células, adicionar 2 mL da solução de descolamento celular (Tabela de Materiais e Reagentes) às células e incubar as células por aproximadamente 5 min a 37 °C.
      nota: A solução de descolamento contém enzimas proteolíticas e colagenolíticas em 1x PBS, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM e vermelho de fenol 3 mg/L. Reduza ao mínimo o tempo de pré-aquecimento da solução de descolamento celular, pois esta ficará inativa após 1 h a 37 °C. Cubra toda a camada celular para obter o descolamento celular ideal.
   4. Verifique o descolamento das células usando um microscópio invertido.
   5. Transfira todas as células destacadas para um tubo de 50 ml pré-preenchido com 10 ml de meio de cultura celular (o mesmo que o utilizado no passo 1.1.1.) e ressuspenda as células pipetando.
   6. Coloque a suspensão de célula restante em um misturador de rolos horizontal em RT e prossiga para a etapa de rotulagem.
2. Marcação de células vivas de células-alvo
   1. Diluir 1 μL de CFSE 5 mM (fornecido em dimetilsulfóxido, DMSO) em 1 mL de 1x PBS pré-aquecido a 37 °C para obter a solução de marcação CFSE pronta para uso de 5 μM.
      nota: Para obter os melhores resultados de coloração, use soluções recém-preparadas.
   2. Prepare uma solução de coloração de DNA pronta para uso (Tabela de Materiais e Reagentes) em 1x PBS e armazene-a a 2-6 °C protegida da luz.
      nota: Para obter os melhores resultados de coloração, use soluções recém-preparadas.
   3. Retire as células do misturador de rolos horizontal (passo 1.1.6.) e pelete as células a 300 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 ml de 1x PBS.
   4. Enxágue as células novamente com 1x PBS e ressuspenda o pellet celular em uma solução de marcação CFSE pronta para uso de 500 μL.
   5. Incubar as células a 37 °C durante 15 min e recolher as células após centrifugação a 300 x g durante 3 min.
   6. Ressuspenda as células marcadas em 1 mL de meio de cultura celular pré-aquecido e deixe as células se regenerarem a 37 ° C por 30 min.
   7. Colha as células por centrifugação a 300 x g por 3 min e ressuspenda os grânulos celulares em 1 mL de solução de coloração de DNA pronta para uso a 37 ° C por 10 min.
   8. Pulverize as células, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 4 mL de 1x PBS. Avalie a densidade celular usando um hemocitômetro e verifique a marcação de fluorescência usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 1A e 1E).
   9. Centrifugar as células a 300 x g durante 3 min e ressuspender o sedimento celular de acordo com as densidades celulares necessárias para a respetiva experiência, conforme indicado na secção seguinte, e colocar sobre gelo.

2. Carregando o fio

NOTA: As células podem ser isoladas de picos de células-alvo/sangue periférico na escala de mililitros ou fornecendo um baixo número de células em uma escala de microlitros. Enquanto a primeira abordagem permite imitar condições de células raras no sangue periférico, a última pode ser a maneira preferida de anexar algumas células para fins de otimização / teste de protocolo.

1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células
   1. Prepare uma solução de bloqueio de BSA a 2% dissolvendo 0,8 g de BSA em 40 mL de 1x PBS (uso de cultura de células). Dissolva o BSA por vórtice inicial e subsequente incubação em RT em um misturador de rolos horizontal por 10-20 min.
   2. Enxágue os tubos de EDTA vazios / tubos de heparina sódica com 2 mL de BSA a 2% para remover os resíduos de anticoagulantes e descarte a solução. Bloqueie a superfície do tubo por incubação em RT com 5 mL de BSA a 2% em um misturador de rolos horizontal a 15 rpm por 30 min e descarte a solução.
   3. Dilua as células marcadas (seção 1.2.) para uma densidade de 100.000 células/mL e use 5 mL para carregar o fio.
   4. Adicione 5 mL da suspensão celular marcada (500.000 células no total) ao tubo. Evite bolhas ao adicionar a suspensão celular.
   5. Remova o fio do compartimento de armazenamento, bem como a tampa de borracha que prende o fio e enxágue-o em 1x PBS (Figura 2).
   6. Penetre na tampa do tubo de borracha do tubo EDTA (passo 2.1.4.) com a ajuda de uma agulha de seringa (20 G) e insira o fio de forma que a parte funcional fique totalmente imersa na suspensão da célula quando a tampa estiver de volta no tubo e o tubo colocado no misturador de rolos inclinado.
      nota: A parte funcional de tripla hélice do fio deve ser coberta com suspensão de célula durante todo o carregamento.
   7. Gire os tubos em uma batedeira de rolos inclinada a 5 rpm por 30 min para permitir que as células se prendam ao fio.
   8. Enxágue o fio com 5 mL 1x PBS e guarde-o no escuro a 2-6 °C em um tubo de 15 mL contendo 1x PBS até o exame visual.
      nota: A parte funcional do fio deve estar sempre submersa em PBS para evitar danos às células.
2. Isolar as células-alvo de misturas artificiais com sangue periférico (método de carregamento alternativo para: 2.1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células)
   1. Dilua as células marcadas (seção 1.2.) para obter suspensões celulares com alta densidade celular (> 1.000.000 células / mL), mantendo assim o volume de suspensão celular adicionado ao sangue periférico baixo.
   2. Adicione 500 a 500.000 células a 5 mL de sangue periférico e misture-as invertendo o tubo.
   3. Remova o fio do compartimento de armazenamento, remova a tampa de borracha que prende o fio e enxágue-o em 1x PBS.
   4. Penetre uma nova tampa de tubo com a parte não funcional do dispositivo usando uma agulha de seringa (20 G) de modo que a parte funcional esteja totalmente imersa no sangue enriquecido quando a tampa estiver de volta no tubo e o tubo for colocado no misturador de rolos inclinado.
      nota: A parte funcional de tripla hélice do fio deve ser coberta com suspensão de célula durante todo o carregamento.
   5. Incube o tubo no misturador de rolos inclinado a 5 rpm por 30 min em RT.
   6. Enxágue o fio três vezes em 1x PBS e guarde-o no escuro em um tubo de 15 mL contendo 1x PBS até o exame visual.
      nota: A parte funcional do fio deve estar sempre submersa para evitar danos às células.
3. Carregar o fio de suspensões de células de baixo volume (método de carregamento alternativo para: 2.1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células)
   1. Ressuspenda as células marcadas a 1.000.000 células/mL em 1x PBS.
   2. Fixe uma pipeta Pasteur de vidro descartável de 150 mm horizontalmente em um rack.
   3. Remova o fio do compartimento de armazenamento, mas mantenha a tampa de borracha amarela segurando o fio.
   4. Coloque o fio na pipeta de forma que a parte funcionalizada fique situada na ponta da pipeta Pasteur sem tocar no vidro.
      nota: A ponta do fio não deve ficar para fora da ponta da pipeta Pasteur. Evite obstruir a extremidade traseira da ponta da pipeta Pasteur com a tampa de borracha que segura o fio. Se bem presas, as suspensões de células não podem ser carregadas do outro lado para a ponta da pipeta.
   5. Carregue 15 μL da suspensão celular na ponta da pipeta Pasteur cobrindo a parte funcionalizada do fio.
   6. Incube o fio por 10 min. Gire manualmente o fio montado/ponta da pipeta Pasteur a cada minuto.
   7. Retirar o fio da ponta da pipeta Pasteur, enxaguar em 5 mL de 1x PBS e guardar no escuro a 2-6 °C em tubo de 15 mL contendo 1x PBS até exame visual.
      nota: A parte funcional deve estar sempre submersa em 1x PBS para evitar danos às células.

3. Contando células no fio

NOTA: Sempre mantenha a parte funcional do fio submersa em 1x PBS para evitar danificar as células.

1. Use uma caneta de graxa para desenhar uma área retangular em uma lâmina de vidro e adicione 500 μL de 1x PBS.
2. Dobre a parte não funcional do fio e coloque-a na lâmina de vidro de forma que a parte funcional fique imersa em 1x PBS.
   nota: Ajuste a área do retângulo e o volume de 1x PBS para cobrir completamente a parte funcional do fio. Use uma fita adesiva dupla face para montar a parte não funcional do fio na lâmina.
3. Inspecione visualmente ambos os lados do fio para enumerar as células capturadas (Figura 1B e 1F).
   nota: A presença de células é determinada usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI e FITC. Ambos os lados do fio podem ser inspecionados e o número de células avaliado (para números altos de células) ou contado (apenas viável se um número baixo de células estiver conectado ao fio). Esta etapa pode ser ignorada se a enumeração de células não for necessária.
4. Após a digitalização, coloque o fio de volta no tubo de 15 mL contendo o 1x PBS, guarde o fio no escuro.
   nota: A maior parte da parte não funcional do fio pode ser cortada (incluindo a dobra) e removida, facilitando o armazenamento.

4. Descolamento e recuperação de células-alvo

NOTA: O descolamento das células deve ser feito dentro de 4 h após o isolamento.

1. Dissolva 4 mg do componente tampão de liberação (Tabela de Materiais e Reagentes) por mL de 1x PBS e filtre a solução através de um filtro estéril de 0,2 μm para obter o tampão pronto para uso.
   nota: O polímero do fio é composto por um hidrogel que é funcionalizado com anticorpos anti-EpCAM permitindo a ligação às células-alvo apresentadoras de EpCAM. O tampão de liberação contém uma enzima proteolítica carbono-oxigênio capaz de clivar o hidrogel. A clivagem proteolítica resulta na degradação do polímero e, portanto, no desprendimento das células capturadas.
2. Pré-aqueça o tampão de liberação a 37 °C por 5 min.
3. Adicione 1,6 mL de tampão de liberação para encher um tubo de reação de 1,5 mL.
   nota: Os tubos projetados para volumes de reação de 1,5 mL permitem a aplicação de 1,6 mL, o que é necessário para submergir a parte funcional do fio.
4. Incube a parte funcional do fio no tampão de liberação a 37 °C (banho-maria) por 20 min. Use a tampa de borracha enviada com o fio em vez da tampa do tubo para fixar o fio no tubo de 1,5 mL para evitar contaminação durante a incubação no banho-maria.
5. Transfira o conjunto fio/tubo para um agitador em RT e 500 rpm por 15 min.
   nota: O agitador tem uma órbita de 1,5 mm.
6. Coloque o conjunto fio/tubo em uma centrífuga e gire-o a 300 x g por 10 min.
7. Remova o fio do tubo, feche a tampa e centrifugue o tubo novamente a 300 x g por 10 min.
   nota: O fio pode ser armazenado em 1x PBS a 2-6 °C no escuro para contagem de células para avaliar a eficiência do desprendimento/verificar se há células restantes no fio.
8. Para reduzir o volume da suspensão celular, remova tudo, exceto 100 μL (micromanipulação) ou, alternativamente, 300 μL (citocentrifugação e subsequente microdissecção a laser) do sobrenadante e prossiga imediatamente para a amostragem de célula única.

Figura 1: Visualizando células marcadas.(A,E) Células antes do carregamento: As células são marcadas com CFSE e contracoradas com um corante intercalante de DNA mostrando uma faixa de intensidade de sinal CFSE (verde). (B,F) Células marcadas capturadas no fio. (C,G) Fio após o procedimento de descolamento celular. (D, H) Células separadas do fio e recuperadas por citocentrifugação em uma lâmina. CFSE: canal FITC (verde). Coloração de DNA: canal DAPI (azul).

Figura 2: Figura 2: Fio e compartimento de armazenamento.(A) Compartimentos do fio. (B) Detalhe da peça funcionalizada.