Isolamento de células-alvo baseado em fio funcionalizado: uma técnica ex vivo para isolar células cancerígenas do sangue periférico enriquecido

Resumo

Fonte: Chen S. et al. Pré-enriquecimento da célula-alvo e amplificação do genoma completo para caracterização a jusante de célula única. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células epiteliais de câncer que expressam EpCAM a partir de amostras de sangue periférico. A técnica envolve o uso de um fio de grau médico funcionalizado com anticorpos EpCAM para capturar as células-alvo. As células capturadas são então posteriormente extraídas para uma solução tampão.

Protocolo

NOTA: Este protocolo descreve o isolamento de células HT-29 (linha celular de câncer de cólon humano) de PBS ou de misturas artificiais de células HT-29 e sangue periférico. O mesmo experimento foi realizado com duas linhagens celulares adicionais (LNCaP e VCaP) e teoricamente pode ser realizado com todas as células que expressam EpCAM.

1. Preparação de células-alvo

1. Cultura celular e marcação de células
   nota: Neste protocolo, as células são cultivadas em frascos de cultura de 75 cm². Ajuste as quantidades de reagentes de acordo se outros dispositivos de cultura de células forem usados (por exemplo, placas de cultura de 25 cm², placas de 6 poços, etc.). Todos os líquidos utilizados são pré-aquecidos a 37 °C em banho-maria. Se não for indicado o contrário, todas as etapas do protocolo são executadas à temperatura ambiente (RT).
   1. Cultura de células HT-29 em meio modificado McCoy's 5a suplementado com 2 mM de L-glutamina, 20 mM de Hepes, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂.
   2. Quando as células estiverem 90% confluentes, remova o meio e enxágue as células com 10 mL de 1x PBS.
   3. Para colher células, adicionar 2 mL da solução de descolamento celular (Tabela de Materiais e Reagentes) às células e incubar as células por aproximadamente 5 min a 37 °C.
      nota: A solução de descolamento contém enzimas proteolíticas e colagenolíticas em 1x PBS, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 mM e vermelho de fenol 3 mg/L. Reduza ao mínimo o tempo de pré-aquecimento da solução de descolamento celular, pois esta ficará inativa após 1 h a 37 °C. Cubra toda a camada celular para obter o descolamento celular ideal.
   4. Verifique o descolamento das células usando um microscópio invertido.
   5. Transfira todas as células destacadas para um tubo de 50 ml pré-preenchido com 10 ml de meio de cultura celular (o mesmo que o utilizado no passo 1.1.1.) e ressuspenda as células pipetando.
   6. Coloque a suspensão de célula restante em um misturador de rolos horizontal em RT e prossiga para a etapa de rotulagem.
2. Marcação de células vivas de células-alvo
   1. Diluir 1 μL de CFSE 5 mM (fornecido em dimetilsulfóxido, DMSO) em 1 mL de 1x PBS pré-aquecido a 37 °C para obter a solução de marcação CFSE pronta para uso de 5 μM.
      nota: Para obter os melhores resultados de coloração, use soluções recém-preparadas.
   2. Prepare uma solução de coloração de DNA pronta para uso (Tabela de Materiais e Reagentes) em 1x PBS e armazene-a a 2-6 °C protegida da luz.
      nota: Para obter os melhores resultados de coloração, use soluções recém-preparadas.
   3. Retire as células do misturador de rolos horizontal (passo 1.1.6.) e pelete as células a 300 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 ml de 1x PBS.
   4. Enxágue as células novamente com 1x PBS e ressuspenda o pellet celular em uma solução de marcação CFSE pronta para uso de 500 μL.
   5. Incubar as células a 37 °C durante 15 min e recolher as células após centrifugação a 300 x g durante 3 min.
   6. Ressuspenda as células marcadas em 1 mL de meio de cultura celular pré-aquecido e deixe as células se regenerarem a 37 ° C por 30 min.
   7. Colha as células por centrifugação a 300 x g por 3 min e ressuspenda os grânulos celulares em 1 mL de solução de coloração de DNA pronta para uso a 37 ° C por 10 min.
   8. Pulverize as células, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 4 mL de 1x PBS. Avalie a densidade celular usando um hemocitômetro e verifique a marcação de fluorescência usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Figura 1A e 1E).
   9. Centrifugar as células a 300 x g durante 3 min e ressuspender o sedimento celular de acordo com as densidades celulares necessárias para a respetiva experiência, conforme indicado na secção seguinte, e colocar sobre gelo.

2. Carregando o fio

NOTA: As células podem ser isoladas de picos de células-alvo/sangue periférico na escala de mililitros ou fornecendo um baixo número de células em uma escala de microlitros. Enquanto a primeira abordagem permite imitar condições de células raras no sangue periférico, a última pode ser a maneira preferida de anexar algumas células para fins de otimização / teste de protocolo.

1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células
   1. Prepare uma solução de bloqueio de BSA a 2% dissolvendo 0,8 g de BSA em 40 mL de 1x PBS (uso de cultura de células). Dissolva o BSA por vórtice inicial e subsequente incubação em RT em um misturador de rolos horizontal por 10-20 min.
   2. Enxágue os tubos de EDTA vazios / tubos de heparina sódica com 2 mL de BSA a 2% para remover os resíduos de anticoagulantes e descarte a solução. Bloqueie a superfície do tubo por incubação em RT com 5 mL de BSA a 2% em um misturador de rolos horizontal a 15 rpm por 30 min e descarte a solução.
   3. Dilua as células marcadas (seção 1.2.) para uma densidade de 100.000 células/mL e use 5 mL para carregar o fio.
   4. Adicione 5 mL da suspensão celular marcada (500.000 células no total) ao tubo. Evite bolhas ao adicionar a suspensão celular.
   5. Remova o fio do compartimento de armazenamento, bem como a tampa de borracha que prende o fio e enxágue-o em 1x PBS (Figura 2).
   6. Penetre na tampa do tubo de borracha do tubo EDTA (passo 2.1.4.) com a ajuda de uma agulha de seringa (20 G) e insira o fio de forma que a parte funcional fique totalmente imersa na suspensão da célula quando a tampa estiver de volta no tubo e o tubo colocado no misturador de rolos inclinado.
      nota: A parte funcional de tripla hélice do fio deve ser coberta com suspensão de célula durante todo o carregamento.
   7. Gire os tubos em uma batedeira de rolos inclinada a 5 rpm por 30 min para permitir que as células se prendam ao fio.
   8. Enxágue o fio com 5 mL 1x PBS e guarde-o no escuro a 2-6 °C em um tubo de 15 mL contendo 1x PBS até o exame visual.
      nota: A parte funcional do fio deve estar sempre submersa em PBS para evitar danos às células.
2. Isolar as células-alvo de misturas artificiais com sangue periférico (método de carregamento alternativo para: 2.1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células)
   1. Dilua as células marcadas (seção 1.2.) para obter suspensões celulares com alta densidade celular (> 1.000.000 células / mL), mantendo assim o volume de suspensão celular adicionado ao sangue periférico baixo.
   2. Adicione 500 a 500.000 células a 5 mL de sangue periférico e misture-as invertendo o tubo.
   3. Remova o fio do compartimento de armazenamento, remova a tampa de borracha que prende o fio e enxágue-o em 1x PBS.
   4. Penetre uma nova tampa de tubo com a parte não funcional do dispositivo usando uma agulha de seringa (20 G) de modo que a parte funcional esteja totalmente imersa no sangue enriquecido quando a tampa estiver de volta no tubo e o tubo for colocado no misturador de rolos inclinado.
      nota: A parte funcional de tripla hélice do fio deve ser coberta com suspensão de célula durante todo o carregamento.
   5. Incube o tubo no misturador de rolos inclinado a 5 rpm por 30 min em RT.
   6. Enxágue o fio três vezes em 1x PBS e guarde-o no escuro em um tubo de 15 mL contendo 1x PBS até o exame visual.
      nota: A parte funcional do fio deve estar sempre submersa para evitar danos às células.
3. Carregar o fio de suspensões de células de baixo volume (método de carregamento alternativo para: 2.1. Carregando o fio usando um grande volume de suspensões de células)
   1. Ressuspenda as células marcadas a 1.000.000 células/mL em 1x PBS.
   2. Fixe uma pipeta Pasteur de vidro descartável de 150 mm horizontalmente em um rack.
   3. Remova o fio do compartimento de armazenamento, mas mantenha a tampa de borracha amarela segurando o fio.
   4. Coloque o fio na pipeta de forma que a parte funcionalizada fique situada na ponta da pipeta Pasteur sem tocar no vidro.
      nota: A ponta do fio não deve ficar para fora da ponta da pipeta Pasteur. Evite obstruir a extremidade traseira da ponta da pipeta Pasteur com a tampa de borracha que segura o fio. Se bem presas, as suspensões de células não podem ser carregadas do outro lado para a ponta da pipeta.
   5. Carregue 15 μL da suspensão celular na ponta da pipeta Pasteur cobrindo a parte funcionalizada do fio.
   6. Incube o fio por 10 min. Gire manualmente o fio montado/ponta da pipeta Pasteur a cada minuto.
   7. Retirar o fio da ponta da pipeta Pasteur, enxaguar em 5 mL de 1x PBS e guardar no escuro a 2-6 °C em tubo de 15 mL contendo 1x PBS até exame visual.
      nota: A parte funcional deve estar sempre submersa em 1x PBS para evitar danos às células.

3. Contando células no fio

NOTA: Sempre mantenha a parte funcional do fio submersa em 1x PBS para evitar danificar as células.

1. Use uma caneta de graxa para desenhar uma área retangular em uma lâmina de vidro e adicione 500 μL de 1x PBS.
2. Dobre a parte não funcional do fio e coloque-a na lâmina de vidro de forma que a parte funcional fique imersa em 1x PBS.
   nota: Ajuste a área do retângulo e o volume de 1x PBS para cobrir completamente a parte funcional do fio. Use uma fita adesiva dupla face para montar a parte não funcional do fio na lâmina.
3. Inspecione visualmente ambos os lados do fio para enumerar as células capturadas (Figura 1B e 1F).
   nota: A presença de células é determinada usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros para DAPI e FITC. Ambos os lados do fio podem ser inspecionados e o número de células avaliado (para números altos de células) ou contado (apenas viável se um número baixo de células estiver conectado ao fio). Esta etapa pode ser ignorada se a enumeração de células não for necessária.
4. Após a digitalização, coloque o fio de volta no tubo de 15 mL contendo o 1x PBS, guarde o fio no escuro.
   nota: A maior parte da parte não funcional do fio pode ser cortada (incluindo a dobra) e removida, facilitando o armazenamento.

4. Descolamento e recuperação de células-alvo

NOTA: O descolamento das células deve ser feito dentro de 4 h após o isolamento.

1. Dissolva 4 mg do componente tampão de liberação (Tabela de Materiais e Reagentes) por mL de 1x PBS e filtre a solução através de um filtro estéril de 0,2 μm para obter o tampão pronto para uso.
   nota: O polímero do fio é composto por um hidrogel que é funcionalizado com anticorpos anti-EpCAM permitindo a ligação às células-alvo apresentadoras de EpCAM. O tampão de liberação contém uma enzima proteolítica carbono-oxigênio capaz de clivar o hidrogel. A clivagem proteolítica resulta na degradação do polímero e, portanto, no desprendimento das células capturadas.
2. Pré-aqueça o tampão de liberação a 37 °C por 5 min.
3. Adicione 1,6 mL de tampão de liberação para encher um tubo de reação de 1,5 mL.
   nota: Os tubos projetados para volumes de reação de 1,5 mL permitem a aplicação de 1,6 mL, o que é necessário para submergir a parte funcional do fio.
4. Incube a parte funcional do fio no tampão de liberação a 37 °C (banho-maria) por 20 min. Use a tampa de borracha enviada com o fio em vez da tampa do tubo para fixar o fio no tubo de 1,5 mL para evitar contaminação durante a incubação no banho-maria.
5. Transfira o conjunto fio/tubo para um agitador em RT e 500 rpm por 15 min.
   nota: O agitador tem uma órbita de 1,5 mm.
6. Coloque o conjunto fio/tubo em uma centrífuga e gire-o a 300 x g por 10 min.
7. Remova o fio do tubo, feche a tampa e centrifugue o tubo novamente a 300 x g por 10 min.
   nota: O fio pode ser armazenado em 1x PBS a 2-6 °C no escuro para contagem de células para avaliar a eficiência do desprendimento/verificar se há células restantes no fio.
8. Para reduzir o volume da suspensão celular, remova tudo, exceto 100 μL (micromanipulação) ou, alternativamente, 300 μL (citocentrifugação e subsequente microdissecção a laser) do sobrenadante e prossiga imediatamente para a amostragem de célula única.

Resultados

Figura 1: Visualizando células marcadas.(A,E) Células antes do carregamento: As células são marcadas com CFSE e contracoradas com um corante intercalante de DNA mostrando uma faixa de intensidade de sinal CFSE (verde). (B,F) Células marcadas capturadas no fio. (C,G) Fio após o procedimento de descola...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gilupi Liberar Buffer	Gilupi	GIL083	Usado para separar células do fio
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. com L-Glutamina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 16600-082	Meio de cultura usado para células HT-29, adapte o meio de cultura à linha celular usada para os experimentos
Solução tampão HEPES (1 m)	PAA	S11-001	Suplemento para o meio 5A da McCoy
Soro Bovino Fetal Gold	PAA	A15-151	Suplemento para o meio modificado McCoy's 5a
Penicilina-estreptomicina (100x)	Biooeste	L0018-100	Suplemento para o meio modificado McCoy's 5a
Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Científico	10010-015
Accutase	Biooeste	L0950-100	Solução de descolamento celular (cultura celular)
Banho-maria	Inglês	Tipo 1003	Usado para soluções de pré-aquecimento
incubadora	Thermo Fisher Científico		Usado para incubar células (cultura de células)
Tubos de reação de 50 mL	VWR	Rolamento 525-0403
Misturador de rolos	Stuart Científico	SRT6D	Usado para prender células ao fio, evitando que as células sedimentem
Kit de proliferação celular CellTrace CFSE	Thermo Fisher Científico	C34554	Usado para marcar células vivas (marcador citoplasmático)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Científico	Usado para corar o DNA (contracoloração nucleica)
Centrífuga (equipada para conter tubos de reação de 15 mL e 50 mL)	Thermo Fisher Científico	Heraeus Megafuge 40R	Usado para peletizar células
Observer Z1 (microscópio de fluorescência/microdissecção a laser)	Carl Zeiss Microimagem		Microscópio invertido (imunofluorescência) capaz de microdissecção a laser; Os microscópios de fluorescência devem ser capazes de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Usado para revestir superfícies de vidro/plástico
Minishaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Usado para vórtice
Tubos de vácuo EDTA (ou Na-heparina)	Bd	366450 (ou 366480)	Usado como tubo de reação para captura ex vivo de células-alvo
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Fio funcionalizado capaz de isolar e separar células positivas para EpCAM (também conhecido como catch&release, C&R)
Agulhas de seringa (G20)	VWR	Nº 613-0554	Usado para perfurar tampas de borracha para permitir que a parte não funcional do C&R passe por ele
Câmara de Neubauer	Roth	T729.1	Usado para contar células
Pipetas Pasteur 150 mm	Volac	D810	Usado para a aplicação de baixo volume de células ao C&R
Caneta de graxa	Dako	S2002	Usado em lâminas de vidro para manter a suspensão da célula no lugar
Filtro de seringa estéril (0,2 μm)	Corning	431219	Para filtrar o buffer de liberação Gilupi recém-preparado
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	1296-003	Usado para agitação durante o descolamento celular
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	30.125.150
Kit Ampli1 WGA	Biossistemas de silício		A encomendar através da Silicon Biosystems
Axiovert M200 equipado com Mikromanipulator MMJ e CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Use micromanipulação à mão
Microcapilares (25 μm de diâmetro), CustomTip Tipo I	Eppendorf	930001201	Usado para micromanipulação de células
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	Rolamento 710920
Citocentrífuga e equipamento	Hettich	Universal 32	Use citocentrífuga à mão
Termociclador	Bio-Rad	Díade do motor de DNA	Cada termociclador com tampa aquecida pode ser usado
Microcentrífuga	Roth	CX73.1	Use a centrífuga de mesa à mão
MembraneSlide 1.0 PET	Zeiss	Telefone: 415101-4401-050	Lâminas de vidro revestidas com membrana usadas para microdissecção a laser