Amostragem de células únicas usando micromanipulação: uma técnica para isolar células individuais da suspensão de células cancerígenas

Resumo

Fonte: Chen S. et al. Pré-enriquecimento da célula-alvo e amplificação do genoma completo para caracterização a jusante de célula única. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica para isolar células individuais de um conjunto de células-alvo para realizar análises downstream. Neste método, um micromanipulador instalado em um microscópio é usado para isolamento de alta precisão de uma única célula-alvo.

Protocolo

1. Amostragem de célula única

1. Micromanipulação
   NOTA: Para permitir aplicações a jusante, como análise de genoma completo (WGA), células isoladas serão adicionadas a 2 μL de master mix de lise celular. Prepare uma mistura mestre de acordo com o número de células a serem processadas. Calcule volumes extras para perda devido à pipetagem e coloque a mistura mestre de lise celular no gelo.
   1. Prepare o master mix de lise celular (componentes do kit WGA, Tabela de Materiais e Reagentes). Resumidamente, misture 2,0 μL de tampão de reação, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solução a 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol (solução a 10%), 2,6 μL de uma solução de proteinase K e 12,8 μL de água livre de RNase/DNase para obter uma mistura mestre para 10 amostras (volume total de 20 μL).
      nota: Para mais amostras, aumente os volumes de acordo.      
   2. Use uma caneta de graxa para desenhar uma área que mantém a suspensão da célula no lugar. Ajuste a área e o volume se a densidade da célula for muito alta (ou seja, marque uma área maior na lâmina de vidro, carregue 1x PBS e uma alíquota da suspensão da célula).
   3. Pipetar toda a suspensão da célula-alvo na lâmina de vidro.
   4. Transfira a lâmina de vidro para um microscópio equipado com um micromanipulador. Deixe as células repousarem por 5 min.
   5. Prepare tubos de PCR de 0,2 mL carregados com 2,0 μL de mistura principal de lise celular (preparada na etapa 1.1.1.) e armazene-os no gelo.
   6. Colete células individuais em 1 μL de PBS 1x usando o micromanipulador e transfira as células para um tubo contendo o master mix de lise celular.
      nota: Para transferir células micromanipuladas para o tampão de lise celular, coloque o capilar diretamente nos 2 μL de solução de lise e ejete até que as bolhas possam ser vistas.
   7. Gire brevemente a amostra a 2000 x g por 3 s usando uma microcentrífuga de mesa para coletar todo o líquido no fundo do tubo. Coloque as amostras no gelo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Científico	10010-015
Tubos de vácuo EDTA (ou Na-heparina)	Bd	366450 (ou 366480)	Usado como tubo de reação para captura ex vivo de células-alvo
Pipetas Pasteur 150 mm	Volac	D810	Usado para a aplicação de baixo volume de células ao C&R
Caneta de graxa	Dako	S2002	Usado em lâminas de vidro para manter a suspensão da célula no lugar
Axiovert M200 equipado com Mikromanipulator MMJ e CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		Use micromanipulação à mão
Microcapilares (25 μm de diâmetro), CustomTip Tipo I	Eppendorf	930001201	Usado para micromanipulação de células
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	Rolamento 710920