Amostragem de célula única usando microdissecção por captura a laser: uma técnica para colher células-alvo de uma população de células heterogêneas

Resumo

Fonte: Chen S. et al. Pré-enriquecimento da célula-alvo e amplificação do genoma completo para caracterização a jusante de célula única. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica para obter uma única célula de uma população de células heterogêneas usando microdissecção por captura a laser. A única célula isolada pode ser usada para estudos genômicos adicionais ou pesquisas sobre o câncer.

Protocolo

1. Amostragem de célula única

1. Microdissecção a laser
   NOTA: Células únicas serão adicionadas a 4,5 μL de master mix de lise celular (componentes do kit WGA, Tabela de Materiais e Reagentes) para WGA.
   1. Preparar a mistura principal de lise celular de acordo com Czyż et al. misturando 5,0 μL de tampão de reação, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solução a 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol (solução a 10%), ou seja, 2,6 μL de uma solução de proteinase K e 34,8 μL de água livre de RNase/DNase para obter uma mistura principal para 10 amostras (volume total de 45 μL). Coloque a mistura master no gelo.
      nota: Para mais amostras, aumente os volumes de acordo.
   2. Trate com UV as lâminas revestidas com membrana adequadas para microdissecção a laser. Coloque as lâminas em um dispositivo reticulador de DNA e exponha-as ao UV mais alto por cerca de 10 min.
   3. Monte a lâmina revestida de membrana em uma citocentrífuga e citospin toda a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
      nota: Ao usar um sistema em líquido, onde as células são citocentrífugas na solução de lâmina, remova o sobrenadante após a citocentrifugação e aplique uma centrifugação a seco a 1140 x g por 1 min.
   4. Prossiga diretamente para a microdissecção a laser ou deixe as citospinas secarem ao ar durante a noite e congele as amostras a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
   5. Pipete 4,5 μL de mistura mestre de lise celular na tampa de um tubo de PCR de 0,2 mL e colha células individuais por meio de microdissecção a laser.
   6. Recupere o tubo de PCR do microscópio de microdissecção a laser e feche o tubo. Colete todo o líquido no fundo do tubo por centrifugação curta e coloque a amostra no gelo.
   7. Prossiga com WGA de célula única ou armazene as amostras isoladas a -80 °C por até 1 mês antes do processamento adicional.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. com L-Glutamina	Thermo Fisher Científico	Rolamento 16600-082	Meio de cultura usado para células HT-29, adapte o meio de cultura à linha celular usada para os experimentos
Solução tampão HEPES (1 m)	PAA	S11-001	Suplemento para o meio 5A da McCoy
Soro bovino fetal Gold	PAA	A15-151	Suplemento para o meio modificado McCoy's 5a
Penicilina-estreptomicina (100x)	Biooeste	L0018-100	Suplemento para o meio modificado McCoy's 5a
Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS)	Thermo Fisher Científico	10010-015
Accutase	Biooeste	L0950-100	Solução de descolamento celular (cultura celular)
Banho-maria	Inglês	Tipo 1003	Usado para soluções de pré-aquecimento
incubadora	Thermo Fisher Científico		Usado para incubar células (cultura de células)
Tubos de reação de 50 mL	VWR	Rolamento 525-0403
Misturador de rolos	Stuart Científico	SRT6D	Usado para prender células ao fio, evitando que as células sedimentem
Kit de proliferação celular CellTrace CFSE	Thermo Fisher Científico	C34554	Usado para marcar células vivas (marcador citoplasmático)
Hoechst 33342	H3570	Thermo Fisher Científico	Usado para corar o DNA (contracoloração nucleica)
Centrífuga (equipada para conter tubos de reação de 15 mL e 50 mL)	Thermo Fisher Científico	Heraeus Megafuge 40R	Usado para peletizar células
Observer Z1 (microscópio de fluorescência/microdissecção a laser)	Carl Zeiss Microimagem		Microscópio invertido (imunofluorescência) capaz de microdissecção a laser; Os microscópios de fluorescência devem ser capazes de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) e CFSE (filtro FITC)
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G	Usado para revestir superfícies de vidro/plástico
Minishaker MS1	Sigma-Aldrich	Z404039	Usado para vórtice
Detektor CANCER03 DC03	Gilupi	GIL003	Fio funcionalizado capaz de isolar e separar células EpCAMpositivas (também conhecido como catch&release, C&R)
Agulhas de seringa (G20)	VWR	Nº 613-0554	Usado para perfurar tampas de borracha para permitir que a parte não funcional do C&R passe por ele
Câmara de Neubauer	Roth	T729.1	Usado para contar células
Pipetas Pasteur 150 mm	Volac	D810	Usado para a aplicação de baixo volume de células ao C&R
Caneta de graxa	Dako	S2002	Usado em lâminas de vidro para manter a suspensão da célula no lugar
Delfia PlateShaker	Perkin Elmer	1296-003	Usado para agitação durante o descolamento celular
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	30.125.150
Kit Ampli1 WGA	Biossistemas de silício		A encomendar através da Silicon Biosystems
Tubos de PCR de 0,2 mL	Biozym	Rolamento 710920
Citocentrífuga e equipamento	Hettich	Universal 32	Use citocentrífuga à mão
Termociclador	Bio-Rad	Díade do motor de DNA	Cada termociclador com tampa aquecida pode ser usado
Microcentrífuga	Roth	CX73.1	Use a centrífuga de mesa à mão
UV Stratalinker 1800	Gene Stratagene	400072	Use o reticulador de DNA à mão