Amostragem de célula única usando microdissecção por captura a laser: uma técnica para colher células-alvo de uma população de células heterogêneas

1. Amostragem de célula única

1. Microdissecção a laser
   NOTA: Células únicas serão adicionadas a 4,5 μL de master mix de lise celular (componentes do kit WGA, Tabela de Materiais e Reagentes) para WGA.
   1. Preparar a mistura principal de lise celular de acordo com Czyż et al. misturando 5,0 μL de tampão de reação, 1,3 μL de octilfenoxipolietoxietanol (solução a 10%), 1,3 μL de 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol (solução a 10%), ou seja, 2,6 μL de uma solução de proteinase K e 34,8 μL de água livre de RNase/DNase para obter uma mistura principal para 10 amostras (volume total de 45 μL). Coloque a mistura master no gelo.
      nota: Para mais amostras, aumente os volumes de acordo.
   2. Trate com UV as lâminas revestidas com membrana adequadas para microdissecção a laser. Coloque as lâminas em um dispositivo reticulador de DNA e exponha-as ao UV mais alto por cerca de 10 min.
   3. Monte a lâmina revestida de membrana em uma citocentrífuga e citospin toda a suspensão celular a 300 x g por 5 min.
      nota: Ao usar um sistema em líquido, onde as células são citocentrífugas na solução de lâmina, remova o sobrenadante após a citocentrifugação e aplique uma centrifugação a seco a 1140 x g por 1 min.
   4. Prossiga diretamente para a microdissecção a laser ou deixe as citospinas secarem ao ar durante a noite e congele as amostras a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
   5. Pipete 4,5 μL de mistura mestre de lise celular na tampa de um tubo de PCR de 0,2 mL e colha células individuais por meio de microdissecção a laser.
   6. Recupere o tubo de PCR do microscópio de microdissecção a laser e feche o tubo. Colete todo o líquido no fundo do tubo por centrifugação curta e coloque a amostra no gelo.
   7. Prossiga com WGA de célula única ou armazene as amostras isoladas a -80 °C por até 1 mês antes do processamento adicional.