Injeção intra-prostática de células cancerígenas: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata

Resumo

Fonte: Anker, J. F. et al. Modelo Murino Singênico Ortotópico Bioluminescente e Fluorescente de Câncer de Próstata Dependente de Andrógenos e Resistente à Castração. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para administrar injeção intraprostática de células de câncer de próstata em um modelo de camundongo. Modelos murinos ortotópicos podem ser usados para estudar a origem da doença e a resposta às terapias de tratamento em um ambiente não invasivo e clinicamente relevante.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação pré-operatória do mouse

NOTA: Camundongos domésticos no biotério da universidade por pelo menos uma semana antes da cirurgia para permitir uma adaptação adequada e minimizar o estresse animal. As etapas 1.1-1.6 são executadas pelo assistente do cirurgião. Todas as etapas cirúrgicas subsequentes são realizadas pelo cirurgião usando luvas estéreis e ferramentas cirúrgicas com técnica estéril.

1. Anestesiar os camundongos com isoflurano (2-5% para indução via câmara, 1-3% para manutenção via cone nasal). Verifique a indução completa pela perda do reflexo de pinça do dedo do pé.
2. Pesar os camundongos e administrar pelo menos 0,05 mg/kg do analgésico buprenorfina s.c.
   nota: O peso do mouse ≥20 g é ideal para injeções intra-prostáticas bem-sucedidas.
3. Aplique lubrificação com pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
4. Raspe todo o pelo do abdômen.
5. Esterilize o abdômen por três rodadas de aplicação circular de esfoliante cirúrgico usando almofadas estéreis não aderentes, seguidas de lenços umedecidos com álcool. Deixe o abdômen secar.
   nota: Para o restante do procedimento cirúrgico, apenas luvas estéreis e instrumentos cirúrgicos devem ser usados para entrar em contato com o abdômen esterilizado do camundongo.
6. Transfira o mouse em decúbito dorsal para uma superfície limpa em uma almofada de aquecimento diretamente sob a objetiva de um microscópio cirúrgico limpo.
7. Cubra o mouse com uma cortina estéril com um pequeno orifício cortado sobre o abdômen.

2. Injeção intra-prostática

NOTA: Execute todas as etapas cirúrgicas em condições estéreis. O ajuste do microscópio, a colocação do mouse ou qualquer outro objeto não estéril deve ser feito com assistência adicional.

1. Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm da pele externa ao longo da linha média do abdômen superior ao pênis e às glândulas prepuciais (Figura 1D).
2. Separe o tecido conjuntivo entre a pele abdominal externa e a musculatura abdominal interna abrindo a tesoura entre as camadas.
3. Faça uma incisão semelhante nos músculos abdominais internos, usando uma pinça para elevar os músculos para evitar perfurar os intestinos ou a bexiga (Figura 1D).
4. Localize uma das vesículas seminais bilaterais (Figura 1A, branca) / lobos anteriores da próstata (Figura 1A, preto), que geralmente são posteriores, laterais e ligeiramente superiores à bexiga (Figura 1A, amarelo), mas isso pode variar entre os camundongos. Os lobos anteriores da próstata são translúcidos e ligados à curvatura menor das vesículas seminais brancas.
5. Levante suavemente a ponta da vesícula seminal usando a pinça de tecido de Graefe para criar tensão no tecido sem perfurar a vesícula seminal (Figura 1E).
6. Misture a solução de matrigel Myc-CaP por pipetagem gentil (realizada pelo cirurgião assistente), pois as células podem ter sido peletizadas, e aspire lentamente 30 μL (1x10⁶ células) na agulha para evitar bolhas de ar.
7. Insira cuidadosamente o chanfro da agulha paralelo ao eixo longo do lobo anterior da próstata. Injete lentamente 30 μL no lóbulo e, em seguida, retraia lentamente a agulha para evitar vazamentos (Figura 1F). Verificar injeção adequada por ingurgitamento do lobo anterior da próstata (Figura 1G).
8. Segure cuidadosamente a vesícula seminal e o lobo da próstata fora do camundongo por aproximadamente 30 s para permitir que o matrigel se solidifique parcialmente dentro do lobo. Durante esse período, colete qualquer vazamento de solução celular no abdômen usando um aplicador estéril com ponta de poliéster para evitar o desenvolvimento de tumor não ortotópico sem pressionar o lobo da próstata injetado.
9. Retorne cuidadosamente a vesícula seminal e o lobo da próstata injetado no abdômen sem pressionar o lobo. Substitua todos os tecidos externalizados.
10. Realize suturas contínuas para fechar os músculos abdominais internos com suturas de agulha de corte reverso absorvíveis de vicryl 5-0.
11. Realize suturas interrompidas para fechar a pele abdominal externa com suturas de agulha de corte reverso não absorvíveis de monofilamento de nylon 4-0. nota: Grampos esterilizados de 9 mm também podem ser usados para fechar a pele abdominal externa. No entanto, em contraste com as suturas, eles interferem em qualquer sinal de imagem tumoral bioluminescente e fluorescente subsequente.
12. Limpe todas as ferramentas com lenços esterilizados de etanol (abertos pelo assistente do cirurgião) e coloque-as em um esterilizador de esferas de vidro por 30 s. Deixe as ferramentas secarem antes de usar no próximo mouse.
13. Lave a seringa e a agulha em soro fisiológico estéril (aberto pelo assistente do cirurgião) para evitar o entupimento pelo matrigel remanescente.
    nota: Um cirurgião assistente deve estar presente para todas as operações, realizando toda a preparação pré-operatória não estéril do camundongo e cuidados pós-operatórios com camundongos, bem como misturando a solução de matrigel Myc-CaP antes das injeções. Para minimizar o tempo, como cada procedimento intra-prostático em camundongo exigirá de 20 a 30 minutos, o cirurgião assistente pode começar a preparar o próximo camundongo enquanto o cirurgião está suturando o camundongo atual.

3. Cuidados pós-operatórios com camundongos

1. Administrar 1 mg/kg do analgésico meloxicam s.c. imediatamente, 24 h e 48 h após a cirurgia.
2. Permita que os ratos se recuperem em uma gaiola sem cama colocada no meio de uma almofada de aquecimento. Monitore os camundongos por pelo menos 30 minutos após a cirurgia até que eles recuperem a mobilidade e a atividade normais, após o que coloque-os em uma gaiola limpa com comida no chão da gaiola.
3. Monitore ainda mais os ratos diariamente para cicatrização adequada de feridas, peso corporal, higiene e deambulação após a cirurgia. Separe os ratos em gaiolas individuais mediante qualquer evidência de luta.
4. Remova quaisquer suturas restantes dentro de 14 dias após a cirurgia.

Resultados

Figura 1: Lobo anterior da próstata, drenagem de linfonodos e técnica representativa para injeções intra-prostáticas de células. Imagens do (A) lobo anterior direito da próstata (preto, *), vesícula seminal direita anexada (branca), testículo direito e coxim adiposo (verde) e bexiga (amarelo), (B) linfonodos para-aórticos bilaterais de drenagem da próstata (laranja),...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular Myc-CaP	ATCC	CRL-3255	Verifique se está livre de micoplasma antes de usar
Tesoura de microdissecação	Roboz	RS-5910
Pinça Graege	Roboz	RS-5135
Pinça de tecido Graefe	Roboz	RS-5150
Porta-agulhas Olsen-Hegar com cortadores de sutura	Festa	12002-12
Seringa de 50 μL 705 RN SYR	Hamilton	7637-01	Esterilizar por gás óxido de etileno
Agulhas de calibre 28 Cubo Pequeno RN H	Hamilton	7803-02	Estilo de ponta 4, Ângulo 45°, Comprimento 0.75 pol. Esterilizado por gás óxido de etileno
RPMI	Gibco	18875-093
FBS	Gibco	Rolamento 10437-028
Pencillin/estreptomicina	Gibco	15140-122
Pbs	Gibco	14190-144
Membrana basal Matrigel matriz, sem vermelho de fenol, sem LDEV	Corning	356237	Descongele no gelo a 4°C durante a noite antes de usar
Isoflurano	Henry Schein	11695-0500-2	Adquirido do Centro de Medicina Comparada da Northwestern University (CCM)
Hirocloreto de buprenorfina 0,3 mg/mL		12496-0757-5	Substância controlada adquirida da Northwestern University CCM
26 seringas de calibre 5/8	Bd	309597	Para injeções de meloxicam e buprenorfina
Lubrificação de pomada oftálmica	Akron	Rolamento 17478-162-35
Esfoliação cirúrgica Betadine (povidoniodina, 7,5%)	Produtos Purdue	Nº 67618-151-16
Almofadas estéreis não aderentes	Moore Médico	Rolamento 10775
Toalhetes estéreis com álcool	Fisher Científico	22-363-750
Microscópio cirúrgico Stemi DV4	Zeiss
Aplicadores estéreis com ponta de poliéster	puritano	25-806 1PD
5-0 suturas de agulha de corte reverso absorvíveis vicryl	eSuturas	J493G
4-0 suturas de nylon da agulha reversa do corte do monfilamento	eSuturas	699H
Esterilizador de esferas de vidro	Ferramentas de Belas Ciências	18000-45
Solução salina estéril 0,9% cloreto de sódio	Hospira	0409-4888-02