Geração de células de câncer de próstata quimiorresistentes: um procedimento para obtenção de células cancerígenas resistentes a medicamentos in vitro

Neste artigo

Resumo

Fonte: Mohr, L. et al. Geração de Modelos de Células de Câncer de Próstata de Resistência ao Agente Antimitótico Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo descreve um protocolo para gerar modelos celulares de câncer de próstata resistentes a taxanos. Esses modelos podem ajudar a estudar as vias envolvidas na progressão para a resistência ao docetaxel em pacientes com câncer de próstata.

Protocolo

1. Geração de células de câncer de próstata resistentes ao docetaxel

NOTA: Realize tratamentos celulares usando estoque de solução de docetaxel usado para a determinação da concentração do medicamento IC50 (prepare estoque suficiente com antecedência para uso experimental). As células parentais devem ser cultivadas em paralelo em um pequeno frasco durante todo o procedimento e expostas ao veículo (DMSO) em volumes correspondentes, imitando as quantidades usadas nos frascos tratados com docetaxel.

Colocar em placas as células DU145 ou 22Rv1 em balões de^{150 cm 2} contendo 20 ml de meio (3,5 x 10⁶ células por balão para DU145 e 6,5 x 10,6 células por balão para 22Rv1). Recomenda-se o uso de 10 a 20 frascos de células para ter células suficientes no final do protocolo.
Após 24 h, quando as células estiverem a cerca de 70-80% de confluência (Figura 1B, antes do Docetaxel), adicione Docetaxel na concentração IC50 (5 nM para as células descritas neste protocolo).
Após 72 h, aspire o meio contendo o medicamento e adicione meio fresco e livre de Docetaxel (Figura 1B, 72 h após o Docetaxel). Mude a mídia a cada 3-4 dias. Dentro de aproximadamente 1-2 semanas, os clones resistentes aparecerão evidentes ao microscópio (Figura 1B, 7 e 14 dias após o Docetaxel).
Aspire o meio, lave cuidadosamente as células com 15 mL de PBS e incube com 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05% por 3-5 min a 37 ° C para separar as células da superfície do frasco.
Ressuspenda as células tripsinizadas do frasco usando 8 mL de meio fresco. Células de pool de todos os frascos tratados. Células de pellets por centrifugação (300 x g, 3 min, RT).
Remover o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 20 ml de meio fresco e colocar as células em frascos de 150 cm² (3,5 x 10⁶ células por balão para DU145 e 6,5 x 10⁶ células por balão para 22Rv1).
Após 24 h, quando as células estiverem em cerca de 70-80% de confluência, adicione 5 nM de Docetaxel (concentração inicial de IC50) novamente.
Repita as etapas 1.3 a 1.6 no dia 3.
Após 24 h, quando as células estiverem em cerca de 70-80% de confluência, trate-as com concentração de 2X IC50 Docetaxel (10 nM para as células descritas neste protocolo).
Repita as etapas 1.3 a 1.8, após um escalonamento de dose das concentrações de Docetaxel (25 nM, 50 nM, 100 nM e 250 nM), para gerar uma população estável de células crescendo nos frascos sob a concentração final mais alta. Para concentrações mais altas, o protocolo de escalonamento de dose pode ser implementado por até 6 meses até que a concentração de 1.000 nM seja atingida (Figura 2A).

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Resultados

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Figura 1: Geração de sistemas de modelos de células de câncer de próstata resistentes ao docetaxel.(A) Diagrama que descreve a determinação do Docetaxel IC50 nas linhas celulares de câncer de próstata parental DU145 e 22Rv1 (Etapa 1 do protocolo). As porcentagens esperadas de viabilidade celular e as concentrações de aumento da dose de docetaxel necessárias estão incluídas. Gráficos ...