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1. Caracterização funcional da resistência adquirida ao docetaxel por ensaio de formação de colônias
NOTA: Neste protocolo, a quimiorresistência foi avaliada usando ensaios de formação de colônias. Métodos alternativos usados para avaliar a viabilidade celular (ou seja, ensaios MTS) podem ser usados com base nas preferências dos investigadores.
- Placa de 2.000 células (DU145 ou 22Rv1, tanto parental quanto resistente ao docetaxel) por poço em placas de 6 poços, usando 2 mL de meio por poço.
- Após 24 h, adicione concentrações crescentes de Docetaxel (células parentais: 0,25, 0,5, 1, 2,5 e 5 nM; Células DR: 50, 125, 250, 500 e 1.000 nM). Para as linhagens celulares DU145 e 22Rv1. Adicione DMSO apenas a um poço como controle no mesmo volume usado para a dose mais alta de Docetaxel.
- Após 72 h, aspire o meio contendo o medicamento e adicione meio fresco sem docetaxel.
- Incube as placas por 1-2 semanas até que as colônias sejam visíveis ao microscópio.
- Para corar as colônias, lave-as suavemente com 2-3 mL de PBS e incube com 2-3 mL de solução de cristal violeta (0,1% p / v em formalina a 10%) por 20 min dentro da capela de cultura de tecidos ou capela de exaustão.
- Remova a solução de coloração, lave as placas com 2-3 mL de H2O, remova H2O e seque as placas ao ar.
- Analise o resultado visualizando os poços e contando manualmente as colônias com a ajuda de uma caneta marcadora (para evitar contar as mesmas colônias duas vezes) e represente a porcentagem de viabilidade celular em um gráfico. Tire imagens digitais das placas para representação da figura (Figura 1A).
