1. Preparando células para imagens ao vivo
- Cultive células CWR22Rv1 expressando Light Chain 3 acoplada a proteína fluorescente verde (LC3-GFP) em meios de cultura RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos em placas de cultura de fundo de vidro revestidas com poli-D-lisina de 35 mm. As células devem ser plaqueadas com densidade suficiente para facilitar a proliferação rápida, mas não tanto que as células estejam crescidas demais e agrupadas no momento da imagem.
- Trate amostras de células selecionadas com ADI (0,3 μg / mL) em PBS.
- Aproximadamente 1 hora antes da imagem, dilua 1,5 μl de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) com 20 mL de RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos. Use soluções contendo ADI para amostras selecionadas. Aqueça todos os meios a 37 °C antes de adicioná-los à placa de cultura.
- Incube células com RPMI contendo LysoTracker Red DND-99 por 15-45 min a 37 °C.
- Aproximadamente 30 minutos antes da imagem, ligue o gabinete ambiental WeatherStation e deixe equilibrar a 37 ° C e 5% de CO2 (com ar umidificado).
- Lave as células com PBS e substitua o meio por RPMI padrão contendo apenas 10% de FBS e 1% de antibióticos. Adicione ADI às amostras conforme indicado.
- Monte placas de cultura com fundo de lamínula de 35 mm em um adaptador personalizado (Applied Precision, Inc., WA) e posicione na platina do microscópio. Use óleo de imersão (índice de refração 1.520) na lente objetiva 60X 1.42 NA e posicione a placa de cultura montada no palco.
2. Microscopia de iluminação estruturada (OMX) de super-resolução
NOTA: O protocolo nesta seção se aplica ao uso do Microscópio de Iluminação Estruturada OMX (Applied Precision, WA).
- Ligue a alimentação principal e os lasers desejados (410 nm, 488 nm e/ou 532 nm). Aguarde 20 minutos para que os lasers sejam estabilizados termicamente.
- Adicione óleo de imersão (índice de refração 1,516 para amostras fixas em RT) na lente objetiva 60X 1,42 NA. Se forem vistas bolhas na gota de óleo, limpe a objetiva e adicione óleo novamente.
- Coloque a lâmina de amostra no palco e, se necessário, aguarde 10 minutos para que as células se assentem na lamínula.
- Inicialize o programa de aquisição. Use a iluminação de fluorescência para ajustar o foco até que um contorno nítido da célula possa ser visto.
nota: Deve-se tomar cuidado em todos os momentos para minimizar a exposição das células à excitação de fluorescência, até a aquisição real da imagem.
- Uma varredura de mosaico em espiral pode ser adquirida para visualizar áreas maiores da amostra para selecionar células ou regiões de interesse. Recomenda-se usar tempos de exposição curtos (1-10 ms) e baixa potência de excitação (0,1-1% de transmissão) durante a varredura da amostra ou localização de alvos.
- Identifique autofagossomos por fluorescência GFP-LC3. Identifique lisossomos por Alexa Fluor 555 anti-LAMP (proteína de membrana associada a lisossomos) e núcleos celulares usando DAPI (amostras fixas).
- Escolha condições experimentais, incluindo comprimento de onda de excitação, área da imagem (por exemplo, 512x512), espessura da pilha, tempo de exposição e porcentagem de transmissão do laser. Para imagens super-resolvidas, certifique-se de que a opção de iluminação estruturada esteja ativada. Para microscopia de deconvolução no OMX, selecione a opção de iluminação convencional.
- Para obter os melhores resultados de reconstrução, selecione condições experimentais de modo que a contagem máxima de intensidade esteja entre 10.000 e 15.000 durante a aquisição. Se o fotobranqueamento for uma preocupação, a imagem em uma exposição mais baixa (contagens entre 5.000 e 10.000) pode ser usada. Idealmente, as contagens não devem diminuir mais do que um fator de dois durante toda a aquisição, e diminuições de mais de um fator de quatro devem ser evitadas. Se necessário, reduza a espessura da pilha para garantir uma contagem de intensidade sustentada. A câmera satura em 64.000 contagens, portanto, a intensidade máxima nunca deve exceder isso. Para boas amostras, descobrimos que as condições experimentais são de 10 ~ 50 ms de tempo de exposição com 1% de transmissão de laser. Amostras brilhantes e fotoestáveis que podem ser fotografadas repetidamente são preferidas. Uma coloração estável é necessária para imagens super-resolvidas com lapso de tempo.
- Para reduzir o ruído, recomenda-se uma velocidade de leitura de 95 MHz (opção de velocidade média) e um tempo de aquisição de 2 ms ou mais. Artefatos aumentados são obtidos na imagem reconstruída quando a amostra se move durante a aquisição. Devido a esse efeito, exposições curtas são recomendadas para células não aderentes ou de movimento rápido.
- A imagem multicanal pode ser realizada simultaneamente ou sequencialmente. O modo sequencial produz menos diafonia e, portanto, é recomendado.
- Para reduzir o fotobranqueamento, geralmente é recomendado obter imagens com comprimentos de onda de excitação mais longos primeiro (532 nm, 488 nm e depois 410 nm). No entanto, para os resultados experimentais mostrados na Figura 1, essa ordem foi invertida (ou seja, 48 nm, 532 nm e 410 nm) devido à fotoestabilidade dessa amostra em particular.
- Defina o limite superior/inferior da pilha Z movendo o microscópio stageaté que a parte superior/inferior das células esteja ligeiramente fora de foco. A distância desejada entre cada imagem deve ser mantida constante em 0,125 μm para imagens de super-resolução, pois o software de reconstrução assume esse valor como padrão.
- Reconstrua pilhas de imagens usando SoftWorX (Applied Precision, WA) e analise usando VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
