Indução de autofagia baseada em ADI em células de câncer de próstata: uma técnica baseada em enzimas para medir a resposta autofágica em células

1. Preparando células para imagens ao vivo

1. Cultive células CWR22Rv1 expressando Light Chain 3 acoplada a proteína fluorescente verde (LC3-GFP) em meios de cultura RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos em placas de cultura de fundo de vidro revestidas com poli-D-lisina de 35 mm. As células devem ser plaqueadas com densidade suficiente para facilitar a proliferação rápida, mas não tanto que as células estejam crescidas demais e agrupadas no momento da imagem.
2. Trate amostras de células selecionadas com ADI (0,3 μg / mL) em PBS.
3. Aproximadamente 1 hora antes da imagem, dilua 1,5 μl de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) com 20 mL de RPMI contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos. Use soluções contendo ADI para amostras selecionadas. Aqueça todos os meios a 37 °C antes de adicioná-los à placa de cultura.
4. Incube células com RPMI contendo LysoTracker Red DND-99 por 15-45 min a 37 °C.
5. Aproximadamente 30 minutos antes da imagem, ligue o gabinete ambiental WeatherStation e deixe equilibrar a 37 ° C e 5% de CO₂ (com ar umidificado).
6. Lave as células com PBS e substitua o meio por RPMI padrão contendo apenas 10% de FBS e 1% de antibióticos. Adicione ADI às amostras conforme indicado.
7. Monte placas de cultura com fundo de lamínula de 35 mm em um adaptador personalizado (Applied Precision, Inc., WA) e posicione na platina do microscópio. Use óleo de imersão (índice de refração 1.520) na lente objetiva 60X 1.42 NA e posicione a placa de cultura montada no palco.

2. Microscopia de iluminação estruturada (OMX) de super-resolução

NOTA: O protocolo nesta seção se aplica ao uso do Microscópio de Iluminação Estruturada OMX (Applied Precision, WA).

1. Ligue a alimentação principal e os lasers desejados (410 nm, 488 nm e/ou 532 nm). Aguarde 20 minutos para que os lasers sejam estabilizados termicamente.
2. Adicione óleo de imersão (índice de refração 1,516 para amostras fixas em RT) na lente objetiva 60X 1,42 NA. Se forem vistas bolhas na gota de óleo, limpe a objetiva e adicione óleo novamente.
3. Coloque a lâmina de amostra no palco e, se necessário, aguarde 10 minutos para que as células se assentem na lamínula.
4. Inicialize o programa de aquisição. Use a iluminação de fluorescência para ajustar o foco até que um contorno nítido da célula possa ser visto.
   nota: Deve-se tomar cuidado em todos os momentos para minimizar a exposição das células à excitação de fluorescência, até a aquisição real da imagem.
5. Uma varredura de mosaico em espiral pode ser adquirida para visualizar áreas maiores da amostra para selecionar células ou regiões de interesse. Recomenda-se usar tempos de exposição curtos (1-10 ms) e baixa potência de excitação (0,1-1% de transmissão) durante a varredura da amostra ou localização de alvos.
6. Identifique autofagossomos por fluorescência GFP-LC3. Identifique lisossomos por Alexa Fluor 555 anti-LAMP (proteína de membrana associada a lisossomos) e núcleos celulares usando DAPI (amostras fixas).
7. Escolha condições experimentais, incluindo comprimento de onda de excitação, área da imagem (por exemplo, 512x512), espessura da pilha, tempo de exposição e porcentagem de transmissão do laser. Para imagens super-resolvidas, certifique-se de que a opção de iluminação estruturada esteja ativada. Para microscopia de deconvolução no OMX, selecione a opção de iluminação convencional.
8. Para obter os melhores resultados de reconstrução, selecione condições experimentais de modo que a contagem máxima de intensidade esteja entre 10.000 e 15.000 durante a aquisição. Se o fotobranqueamento for uma preocupação, a imagem em uma exposição mais baixa (contagens entre 5.000 e 10.000) pode ser usada. Idealmente, as contagens não devem diminuir mais do que um fator de dois durante toda a aquisição, e diminuições de mais de um fator de quatro devem ser evitadas. Se necessário, reduza a espessura da pilha para garantir uma contagem de intensidade sustentada. A câmera satura em 64.000 contagens, portanto, a intensidade máxima nunca deve exceder isso. Para boas amostras, descobrimos que as condições experimentais são de 10 ~ 50 ms de tempo de exposição com 1% de transmissão de laser. Amostras brilhantes e fotoestáveis que podem ser fotografadas repetidamente são preferidas. Uma coloração estável é necessária para imagens super-resolvidas com lapso de tempo.
9. Para reduzir o ruído, recomenda-se uma velocidade de leitura de 95 MHz (opção de velocidade média) e um tempo de aquisição de 2 ms ou mais. Artefatos aumentados são obtidos na imagem reconstruída quando a amostra se move durante a aquisição. Devido a esse efeito, exposições curtas são recomendadas para células não aderentes ou de movimento rápido.
10. A imagem multicanal pode ser realizada simultaneamente ou sequencialmente. O modo sequencial produz menos diafonia e, portanto, é recomendado.
11. Para reduzir o fotobranqueamento, geralmente é recomendado obter imagens com comprimentos de onda de excitação mais longos primeiro (532 nm, 488 nm e depois 410 nm). No entanto, para os resultados experimentais mostrados na Figura 1, essa ordem foi invertida (ou seja, 48 nm, 532 nm e 410 nm) devido à fotoestabilidade dessa amostra em particular.
12. Defina o limite superior/inferior da pilha Z movendo o microscópio stageaté que a parte superior/inferior das células esteja ligeiramente fora de foco. A distância desejada entre cada imagem deve ser mantida constante em 0,125 μm para imagens de super-resolução, pois o software de reconstrução assume esse valor como padrão.
13. Reconstrua pilhas de imagens usando SoftWorX (Applied Precision, WA) e analise usando VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).

Figura 1. Distribuição de autofagossomas e lisossomas na célula.A. Acima) Comparação lado a lado de imagens adquiridas e reconstruídas no modo DV (deconvolução de campo amplo simulada, à esquerda) e no modo de iluminação estruturada usando o microscópio OMX (à direita). A barra de escala representa 5 μm. B. Inferior) Colocalização em pequena escala de autofagossomos e lisossomos (indicada por setas).