Extração de proteínas e proteólise: um método para obter proteínas de amostras de tecido tumoral de próstata e sua digestão enzimática em peptídeos

Resumo

Fonte: Cheng, L. C. et al. Enriquecimento de fosfopeptídeos acoplado à espectrometria de massa quantitativa sem marcação para investigar o fosfoproteoma no câncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica de extração e digestão de proteínas para obtenção de peptídeos do tecido tumoral da próstata. Esses peptídeos, em análises posteriores, podem ajudar a identificar novos alvos para oncoterapia.

Protocolo

1. Extração de proteínas

1. Prepare o tampão de lise (Tabela 1). (O volume depende do número de amostras a serem colhidas.)
2. Colheita de tecidos
   1. Pese o tumor e adicione 2 mL de tampão de lise gelada para cada 100 mg de tecido em um tubo de ensaio de cultura. (Normalmente, são necessários 50 a 150 mg de peso úmido do tecido.)
3. Homogeneizar o lisado usando um homogeneizador portátil ou de bancada (pulso 2x por 15 s). Limpe o homogeneizador antes da primeira amostra e entre as amostras usando alvejante a 10%, etanol a 70% e água deionizada sucessivamente.
4. Para reduzir e alquilar, aquecer as amostras homogeneizadas a 95 °C durante 5 min. Em seguida, deixe esfriar no gelo por 15 min. No gelo, sonicar o lisado 3x (ou seja, pulsar por 30 s com pausas de 60 s entre os pulsos). A amostra não deve ser viscosa ou grumosa neste momento. Aquecer o lisado a 95 °C durante 5 min.
5. Centrifugar o lisado no mesmo tubo de sonicação utilizando um rotor de balde oscilante a 3.500 x g a 15 °C durante 15 min. Recolher o sobrenadante e rejeitar o sedimento.
6. Determine a concentração de proteínas realizando um ensaio de Bradford. Se necessário, diluir o lisado a 5 mg/ml com um tampão de lise. Armazene-o a -20 °C.
   NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. Congelar as amostras a -80 °C e utilizá-las para análises posteriores.

2. Digestão do lisado

1. Dilua a amostra 12 vezes usando 100 mM Tris (pH = 8,5) para reduzir a quantidade de guanidínio. Dilua todas as amostras no mesmo volume para minimizar os efeitos da digestão desigual. Guarde 12,5 μg do lisado não digerido para confirmá-lo em um gel corado com Coomassie.
2. Para 5 mg de proteína, adicione 10 μg de Lysyl Endopeptidase (Lys-C) e incube-o em temperatura ambiente por 5-6 h. Ajuste o pH para 8,0 adicionando 1 M de Tris não titulado (pH ~ 11).
3. Prepare 1 mg / mL de tripsina tratada com L-1-tosilamido-2-feniletil clorometilcetona (TPCK) em 1 mM de HCl (com 20 mM de CaCl₂). Adicionar a tripsina a uma proporção de 1:100 tripsina:proteína e incubá-la a 37 °C durante 3 h.
4. Adicione a mesma quantidade de tripsina fresca que no passo 2.3. Incubar a 37 °C durante a noite.
5. Economize 12,5 μg do lisado digerido para confirmar a digestão completa em um gel corado com Coomassie.

3. Extração de fase reversa

1. Registre o volume do lisado. Filtrar a amostra utilizando um filtro de corte de 15 ml e 10 kDa. Centrifugue a amostra a 3.500 x g usando o rotor da caçamba oscilante (ou 3.500 x g em um rotor de ângulo fixo) a 15 °C até que o volume do retentado seja inferior a 250 μL (isso leva aproximadamente 45-60 min). Recolha o fluxo e descarte o retentado.

Tabela 1: Buffers e soluções.Esta tabela mostra as composições dos tampões e soluções usadas neste protocolo.

buffer	volume	composição
Tampão de lise de cloreto de guanidínio 6 M	50 mL	6 M de cloreto de guanidínio, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sódio, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glicosídeo, água ultrapura em volume
100 mM de pirofosfato de sódio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sódio deca-hidratado, água ultrapura em volume
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, água ultrapura em volume
Ácido trifluoroacético a 5%	20 mL	Adicione 1 mL de ácido trifluoroacético 100% em 19 mL de água ultrapura
Ácido trifluoroacético a 0,1%	250 mL	Adicione 5 mL de ácido trifluoroacético a 5% a 245 mL de água ultrapura
tampão de eluição pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrila, água ultrapura em volume
tampão de eluição pST	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 50% de acetonitrila, água ultrapura em volume
Buffer de associação de IP	200 mL	50 mM tris pH 7,4, 50 mM cloreto de sódio, água ultrapura para volume
25 mM de bicarbonato de amônio, pH 7,5	10 mL	Dissolva 19,7 mg em 10 mL de água ultrapura estéril, pH a 7,5 com ácido clorídrico 1 N (~ 10-15 μL / 10 ml de solução), faça fresco
Tampão fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de di-hidrogenofosfato de sódio, 577 mL de hidrogenofosfato de sódio 1 M
Amortecedor de equilíbrio	14 mL	6,3 mL de acetonitrila, 280 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 1740 μL de ácido lático, 5,68 mL de água ultrapura
Tampão de enxágue	20 mL	9 mL de acetonitrila, 400 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 10,6 mL de água ultrapura
Solução de espectrometria de massa	10 mL	500 μL de acetonitrila, 200 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 9,3 mL de água ultrapura
Buffer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 5 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
Buffer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 350 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
Hidróxido de amônio a 0,9%	10 mL	300 μL de hidróxido de amônio a 29,42%, 9,7 mL de água ultrapura

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Freezer de temperatura ultrabaixa	Panasonic	MDF-U76V
Congelador -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Caçamba de rotor oscilante	ThermoFisher Scientific	75004377
Rotador de ponta a ponta	ThermoFisher Scientific	Nº 415110Q
Tubos Eppendorf de baixa ligação a proteínas	Eppendorf	22431081
Tripsina tratada com TPCK	Bioquímicos Worthington	LS003740
Lisil Endopeptidase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	125-05061
Água MilliQ			Água deionizada usada para preparar todas as soluções e tampões
Desmembrador Sônico	Fisher Científico	FB-120	sonicador
Sistema Polytron PT	Cinemática AG	PT 10-35 GT	homogeneizador