Extração de proteínas e proteólise: um método para obter proteínas de amostras de tecido tumoral de próstata e sua digestão enzimática em peptídeos

Resumo

Fonte: Cheng, L. C. et al. Enriquecimento de fosfopeptídeos acoplado à espectrometria de massa quantitativa sem marcação para investigar o fosfoproteoma no câncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve a técnica de extração e digestão de proteínas para obtenção de peptídeos do tecido tumoral da próstata. Esses peptídeos, em análises posteriores, podem ajudar a identificar novos alvos para oncoterapia.

Protocolo

1. Extração de proteínas

1. Prepare o tampão de lise (Tabela 1). (O volume depende do número de amostras a serem colhidas.)
2. Colheita de tecidos
   1. Pese o tumor e adicione 2 mL de tampão de lise gelada para cada 100 mg de tecido em um tubo de ensaio de cultura. (Normalmente, são necessários 50 a 150 mg de peso úmido do tecido.)
3. Homogeneizar o lisado usando um homogeneizador portátil ou de bancada (pulso 2x por 15 s). Limpe o homogeneizador antes da primeira amostra e entre as amostras usando alvejante a 10%, etanol a 70% e água deionizada sucessivamente.
4. Para reduzir e alqui....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Freezer de temperatura ultrabaixa	Panasonic	MDF-U76V
Congelador -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Caçamba de rotor oscilante	ThermoFisher Scientific	75004377
Rotador de ponta a ponta	ThermoFisher Scientific	Nº 415110Q
Tubos Eppendorf de baixa ligação a proteínas	Eppendorf	22431081
Tripsina tratada com TPCK	Bioquímicos Worthington	LS003740
Lisil Endopeptidase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	125-05061
Água MilliQ			Água deionizada usada para preparar todas as soluções e tampões
Desmembrador Sônico	Fisher Científico	FB-120	sonicador
Sistema Polytron PT	Cinemática AG	PT 10-35 GT	homogeneizador