Purificação de peptídeos: uma técnica baseada em RP-HPLC para extrair peptídeos de lisados de proteínas digeridas

Resumo

Fonte: Cheng, L. C. et al. Enriquecimento de fosfopeptídeos acoplado à espectrometria de massa quantitativa sem marcação para investigar o fosfoproteoma no câncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa para purificar peptídeos de uma mistura de lisado de proteína digerida. Esses peptídeos purificados são então liofilizados e armazenados para aplicações a jusante. A análise de peptídeos pode ajudar a entender a mecânica envolvida na sinalização celular e no câncer.

Protocolo

1. Extração de Fase Reversa

1. Comece com um lisado de proteína pré-digerido em um frasco de vidro. Filtrar a amostra utilizando um filtro de corte de 15 ml e 10 kDa. Centrifugue a amostra a 3.500 x g usando o rotor da caçamba oscilante (ou 3.500 x g em um rotor de ângulo fixo) a 15 °C até que o volume de retentado seja inferior a 250 μL (isso leva aproximadamente 45 a 60 min). Colete o fluxo e descarte o retentado.
   NOTE: O experimento pode ser pausado aqui. Congelar as amostras a -80 °C para utilização posterior.
2. Para acidificar a amostra, adicione aproximadamente 20 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 5% por mL de lisado. Misture-os bem e meça o pH da amostra usando tiras de pH. Ajuste o pH para 2,5 usando 5% de TFA.
3. Conecte a extremidade mais curta de uma coluna C-18 a um coletor de vácuo. Defina o vácuo entre 17 e 34 kPa (ou de acordo com as instruções do fabricante). Usando pipetas de vidro, umedeça a coluna com 3 mL de acetonitrila 100% (ACN). Não deixe a coluna secar.
4. Usando pipetas de vidro, equilibre a coluna com 6 mL de TFA a 0,1% aplicado como 2x 3 mL. Colocar a amostra acidificada na coluna. Não adicione mais de 3 mL de cada vez. Ajuste o vácuo para atingir cerca de 1 a 2 gotas por segundo.
5. Usando pipetas de vidro, lave a coluna com 9 mL de TFA a 0,1% aplicado como 3x 3 mL. Eluir a coluna com 2 mL de ACN a 40%, TFA a 0,1%. Recolha duas frações de 2 ml em tubos de cultura de vidro. Descarte a coluna.
6. Cubra os tubos de eluído com parafilme e faça 3-5 furos na tampa usando uma agulha de 20G. Congele o eluído em gelo seco por pelo menos 30 min até que solidifique completamente.
7. Liofilize as frações durante a noite. No dia seguinte, certifique-se de que as amostras estejam completamente secas antes de interromper o liofilizante. Armazene os tubos em um tubo cônico de 50 mL com lenços delicados a -80 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Freezer de temperatura ultrabaixa	Panasonic	MDF-U76V
Congelador -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Caçamba de rotor oscilante	ThermoFisher Scientific	75004377
Coletor de vácuo	Restek	Nº 26080
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vácuo de bancada CentriVap	Labconco	7810010
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Rotador de ponta a ponta	ThermoFisher Scientific	Nº 415110Q
Tubos de cultura de vidro	Fisher Científico	Telefone: 14-961-26
Parafilme	Fisher Científico	13-374-12
Agulha 20G	Bd	B305175
Kimwipes	Fisher Científico	06-666A
Tubo criogênico com tampa de rosca	ThermoFisher Scientific	379189
Tubos cônicos Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientific	12-565-268
Tubos Eppendorf de baixa ligação a proteínas	Eppendorf	22431081
Seringa de 3 ml	Bd	309657
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrila (ACN)	Fisher Científico	A21-1
Água MilliQ			Água deionizada usada para preparar todas as soluções e tampões