Enriquecimento de fosfopeptídeos: uma técnica de imunoprecipitação baseada em anticorpos para separar peptídeos fosforilados específicos de misturas complexas de peptídeos

Resumo

Fonte: Cheng, L. C., et al. Enriquecimento de fosfopeptídeos acoplado à espectrometria de massa quantitativa sem marcação para investigar o fosfoproteoma no câncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, demonstramos a imunoprecipitação baseada em anticorpos de fosfopeptídeos de uma mistura de peptídeos. Os fosfopeptídeos enriquecidos são concentrados a vácuo e armazenados para análise a jusante.

Protocolo

1. Imunoprecipitação e enriquecimento de peptídeos pY

1. Ressuspenda o pó liofilizado de digeridos peptídicos purificados com 0,5 mL de tampão de ligação de imunoprecipitação (IP) gelada em cada fração. Agrupe as frações transferindo o volume de ressuspensão de 0,5 mL da segunda fração para a primeira fração e guarde a ponta da pipeta. Vortex vigorosamente (em vez de pipetar para cima e para baixo) para garantir que a amostra esteja completamente dissolvida antes de transferi-la para um criotubo de tampa de rosca de 3,6 mL.
2. Enxágue os tubos de liofilização com mais 0,5 mL de tampão de ligação IP (Tabela 1) em cada tubo. Transfira a solução para o tubo de 3,6 mL com tampa de rosca usando a mesma ponta de pipeta para minimizar a perda de amostra. Repita o enxágue mais 1x, perfazendo o volume final de ressuspensão de 2 mL (para 5 mg de proteína). Meça o pH da amostra para certificar-se de que é aproximadamente 7,4. Se for muito ácido, adicione iterativamente 10 μL de Tris 1M (não titulado, pH ~ 11). Se for muito básico, adicione iterativamente 10 μL de HCl diluído (1:25 ou 1:100).
3. Pré-lave os grânulos pY (para 5 mg de lisado inicial)
   1. São necessários 25 μg de anticorpo 4G10 e 12,5 μg de anticorpo 27B10.4 por amostra. Depois de usar uma pipeta p200 com uma ponta cortada para transferir os anticorpos para tubos de microcentrífuga separados, lave os anticorpos com 450 μL de tampão de ligação IP gelado 2x. Centrifugá-los a 100 x g durante 1 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
   2. Ressuspenda os grânulos a uma concentração de estoque de 0,5 mg / mL usando o tampão de ligação IP. (Não vortex as contas.) Depois de aliquotar a pasta necessária (50 μL de pasta de anticorpos 4G10 e 25 μL de pasta de anticorpos 27B10.4 por amostra) em um único tubo, gire os tubos de centrífuga de estoque a 200 x g por 1 min a 4 ° C. Lave as paredes laterais com sobrenadante antes de retornar os grânulos para armazenamento na geladeira.
4. Adicione grânulos pY pré-lavados à solução de amostra ressuspensa nos tubos criogênicos com tampa de rosca. Incube-os a 4 °C em um rotador de ponta a ponta durante a noite.
5. Coloque os tubos criogênicos com tampa de rosca em um tubo de centrífuga de 50 mL forrado com um lenço delicado. Gire as contas a 100 x g por 1 min. Salve o sobrenadante, que será usado para enriquecer os peptídeos pST.
6. Ressuspenda os grânulos com 300 μL de tampão de ligação IP. Transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 2 mL e gire-os a 100 x g por 1 min a 4 ° C.
7. Enxágue o tubo de incubação 3x com 200 μL de tampão de ligação IP. Transfira o conteúdo para o mesmo tubo de microcentrífuga todas as vezes. Em seguida, gire-os para baixo.
8. Lave os grânulos no tubo da microcentrífuga 3x com 500 μL de tampão de ligação IP e gire-os a 100 x g por 1 min. Em seguida, lave os grânulos 4x com 450 μL de 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5, e gire-os a 100 x g por 1 min. Use uma solução nova de 25 mM NH₄HCO₃ de pó todas as vezes.
9. Centrifugue os grânulos a 1.500 x g por 1 min. Use uma ponta de carregamento de gel para remover completamente o sobrenadante, mergulhando a ponta da ponta de carregamento de gel ligeiramente abaixo da superfície dos grânulos.
10. Adicione 4x o volume do grânulo de 0,1% de TFA aos grânulos (ou seja, adicione 300 μL de 0,1% de TFA para 75 μg de pasta de grânulo pY). Misture bem e incube a mistura em um termomixer a 1.000 rpm por 15 min a 37 °C.
11. Transferir a ressuspensão para um filtro de rotação de 0,2 μm. Gire rapidamente o tubo de eluição e transfira o volume residual para o mesmo filtro de centrifugação usando uma pipeta P10. Gire o filtro de centrifugação a 850 x g por 1 min. Transferir a eluição para um tubo de microcentrífuga de baixa ligação às proteínas. Concentrar o eluído a vácuo até a secura durante a noite a 40 °C e com um tempo de aquecimento de 300 min.
    nota: O experimento pode ser pausado aqui. Congelar as amostras a -80 °C e continuar posteriormente.

Tabela 1: Buffers e soluções.Esta tabela mostra as composições dos tampões e soluções usadas neste protocolo.

buffer	volume	composição
Tampão de lise de cloreto de guanidínio 6 M	50 mL	6 M de cloreto de guanidínio, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sódio, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glicosídeo, água ultrapura em volume
100 mM Pirofosfato de sódio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sódio deca-hidratado, água ultrapura em volume
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, água ultrapura em volume
5% de ácido trifluoroacético	20 mL	Adicione 1 mL de ácido trifluoroacético 100% em 19 mL de água ultrapura
0,1% de ácido trifluoroacético	250 mL	Adicione 5 mL de ácido trifluoroacético a 5% a 245 mL de água ultrapura
tampão de eluição pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrila, água ultrapura em volume
tampão de eluição pST	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 50% de acetonitrila, água ultrapura para volume
Buffer de associação de IP	200 mL	50 mM tris pH 7,4, 50 mM cloreto de sódio, água ultrapura para volume
25 mM Bicarbonato de amônio, pH 7,5	10 mL	Dissolva 19,7 mg em 10 mL de água ultrapura estéril, pH a 7,5 com ácido clorídrico 1 N (~ 10-15 μL / 10 ml de solução), faça fresco
Tampão fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de di-hidrogenofosfato de sódio, 577 mL de hidrogenofosfato de sódio 1 M
Amortecedor de equilíbrio	14 mL	6,3 mL de acetonitrila, 280 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 1740 μL de ácido lático, 5,68 mL de água ultrapura
Tampão de enxágue	20 mL	9 mL de acetonitrila, 400 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 10,6 mL de água ultrapura
Solução de espectrometria de massa	10 mL	500 μL de acetonitrila, 200 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 9,3 mL de água ultrapura
Buffer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 5 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
Buffer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 350 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
0,9% de hidróxido de amônio	10 mL	300 μL de hidróxido de amônio a 29,42%, 9,7 mL de água ultrapura

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vácuo de bancada CentriVap	Labconco	7810010
Kimwipes	Fisher Científico	06-666A
Filtro de rotação Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubos Eppendorf de baixa ligação a proteínas	Eppendorf	22431081
anti-fosfotirosina, agarose, clone: 4G10	Millipore Sigma	Rolamento 16101
27B10.4 anticorpo	Citoesqueleto	APY03-grânulos
Kit de ensaio de peptídeos	Thermo Científico	23275
Dica superior	PolyLC Inc	TT200TIO,96
Colunas SCX (PolySULFOETHYL A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Seringa de 3 ml	Bd	309657
Água MilliQ			Água deionizada usada para preparar todas as soluções e tampões
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrila (ACN)	Fisher Científico	A21-1
Cloreto de potássio	Fisher Científico	BP366-500
Ácido láctico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Hidróxido de amônio	Fisher Científico	A669S-500
Base Tris	Fisher Científico	BP152-5