Enriquecimento de fosfopeptídeos à base de dióxido de titânio: um método para o isolamento seletivo de fosfopeptídeos da biblioteca de peptídeos

Abstract

Fonte: Cheng, L. C. et al. Enriquecimento de fosfopeptídeos acoplado à espectrometria de massa quantitativa sem marcação para investigar o fosfoproteoma no câncer de próstata. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o enriquecimento à base de dióxido de titânio de fosfopeptídeos extraídos do tecido tumoral da próstata. Esses fosfopeptídeos enriquecidos podem ser usados para aplicações a jusante, como caracterização de proteínas, para entender as vias de sinalização celular envolvidas na progressão do câncer de próstata.

Protocol

1. Enriquecimento de dióxido de titânio de peptídeos pY

1. Ressuspenda os fosfopeptídeos secos em 200 μL de 50% de ACN, 0,1% de TFA. Vortex e centrifugue-os a 10.000 x g por 30 s. Repita isso 1x para ressuspendê-los bem.
2. Preparação dos grânulos de TiO₂ contidos em pontas com capacidade para amostras de 200 μL.
   1. Bata suavemente no lado da ponta pequena da ponta para mover o material para essa extremidade. Enxágue a ponta adicionando 200 μL de 100% ACN, seguido de inverter a ponta e sacudir a extremidade menor para mover o líquido em direção à tampa.
   2. Usando uma lâmina de barbear, corte a extremidade menor da ponta e coloque-a sobre um tubo de baixa ligação a proteínas. (Evite usar tubos de poliestireno, pois o TiO₂ grudará nas laterais do tubo.) Remova a tampa e insira uma micropipeta para mergulhar o ACN restante. Repita a lavagem com 200 μL de 100% ACN. Os grânulos de TiO₂ agora estão localizados no tubo de baixa ligação a proteínas para as etapas a seguir.
   3. Pré-condicione TiO₂ com 500 μL de 100% ACN 2x. Pipete-o para misturar os grânulos com o solvente. Centrifugue-os a 100 x g por 1 min.
   4. Condição TiO₂ com 500 μL de tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH ~ 7) 2x. Lave os grânulos com 300 μL de tampão de equilíbrio 3x. Como o TiO₂ é muito denso, as contas se assentam rapidamente.
3. Adicione 400 μL de 50% de ACN, 0,1% de TFA no tubo de baixa ligação a proteínas, seguido pela adição de 84 μL de ácido lático. Transferir os fosfopeptídeos ressuspensos para o tubo de baixa ligação às proteínas e incubá-los durante 1 h à temperatura ambiente utilizando um rotador de ponta a ponta.
4. Centrifugue os grânulos a 100 x g por 1 min para pelletá-los. Lave-os com 300 μL de tampão de equilíbrio (Tabela 1) 2x e gire-os a 100 x g por 1 min.
5. Enxágue as esferas com 300 μL de tampão de enxágue 2x. Transfira-os para um filtro de centrifugação de 0,2 μm. Gire-os a 1.500 x g por 1 min.
6. Transfira a unidade de filtro para um tubo limpo de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas. Eluir o conteúdo 2x com 200 μL de 0,9% NH₃ em H₂O. Meça o pH com tiras de pH, que devem estar entre 10 e 11. Concentre o eluato a vácuo para secar durante a noite para evaporar a amônia.

Tabela 1: Tampões e soluções.Esta tabela mostra as composições dos tampões e soluções usadas neste protocolo.

buffer	volume	composição
Tampão de lise de cloreto de guanidínio 6 M	50 mL	6 M de cloreto de guanidínio, 100 mM de tris pH 8,5, 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina, 40 mM de cloroacetamida, 2 mM de ortovanadato de sódio, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β-glicerofosfato, 500 mg de n-octil-glicosídeo, água ultrapura em volume
100 mM de pirofosfato de sódio	50 mL	2,23 g de pirofosfato de sódio deca-hidratado, água ultrapura em volume
1M β-glicerofosfato	50 mL	15,31 g de β-glicerofosfato, água ultrapura em volume
Ácido trifluoroacético a 5%	20 mL	Adicione 1 mL de ácido trifluoroacético 100% em 19 mL de água ultrapura
Ácido trifluoroacético a 0,1%	250 mL	Adicione 5 mL de ácido trifluoroacético a 5% a 245 mL de água ultrapura
tampão de eluição pY	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 40% de acetonitrila, água ultrapura em volume
tampão de eluição pST	250 mL	0,1% de ácido trifluoroacético, 50% de acetonitrila, água ultrapura em volume
Buffer de associação de IP	200 mL	50 mM tris pH 7,4, 50 mM cloreto de sódio, água ultrapura para volume
25 mM de bicarbonato de amônio, pH 7,5	10 mL	Dissolva 19,7 mg em 10 mL de água ultrapura estéril, pH a 7,5 com ácido clorídrico 1 N (~ 10-15 μL / 10 ml de solução), faça fresco
Tampão fosfato 1M, pH 7	1.000 mL	423 mL 1 M de di-hidrogenofosfato de sódio, 577 mL de hidrogenofosfato de sódio 1 M
Amortecedor de equilíbrio	14 mL	6,3 mL de acetonitrila, 280 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 1740 μL de ácido lático, 5,68 mL de água ultrapura
Tampão de enxágue	20 mL	9 mL de acetonitrila, 400 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 10,6 mL de água ultrapura
Solução de espectrometria de massa	10 mL	500 μL de acetonitrila, 200 μL de ácido trifluoroacético a 5%, 9,3 mL de água ultrapura
Buffer A	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 5 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
Buffer B	250 mL	5 mM de fosfato monopotássico (pH 2,65), 30% de acetonitrila, 350 mM de cloreto de potássio, água ultrapura em volume
Hidróxido de amônio a 0,9%	10 mL	300 μL de hidróxido de amônio a 29,42%, 9,7 mL de água ultrapura

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coletor de vácuo	Restek	Nº 26080
Liofilizador	Labconco	7420020
Concentrador de vácuo de bancada CentriVap	Labconco	7810010
Rotador de ponta a ponta	ThermoFisher Scientific	Nº 415110Q
Lâmina	Fisher Científico	620177
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Tubos cônicos Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientific	12-565-268
Filtro de rotação Millipore 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Tubos Eppendorf de baixa ligação a proteínas	Eppendorf	22431081
anti-fosfotirosina, agarose, clone: 4G10	Millipore Sigma	Rolamento 16101
Kit de ensaio de peptídeos	Thermo Científico	23275
Ácido trifluoracético (TFA)	Fisher Científico	PI-28904
Acetonitrila (ACN)	Fisher Científico	A21-1
Ácido láctico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Hidróxido de amônio	Fisher Científico	A669S-500
Fosfato de potássio monobásico	Fisher Científico	BP362-500
Cloreto de potássio	Fisher Científico	BP366-500
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fisher Científico	BP510-500
Base Tris	Fisher Científico	BP152-5
Ponta Única	PolyLC Inc	TT200TIO,96