Modelagem do câncer de próstata em modelos de camundongos geneticamente modificados: uma técnica de edição de genes localizada mediada por CRISPR/Cas9 em células do lobo anterior da próstata de camundongos

Resumo

Fonte: Riedel, M. et al. Entrega de vírus de guias CRISPR para a próstata murina para alteração genética. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve um método para editar genes específicos em células da próstata usando um sistema de entrega baseado em adenovírus. A abordagem permite a alteração ortotópica e localizada da expressão gênica utilizando a tecnologia CRISPR para desenvolver novos modelos de camundongos para câncer de próstata.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Entrega de vírus à próstata murina

1. Anestesiar o animal por injeção intraperitoneal com uma seringa estéril de 1 mL e uma agulha de 27G x 1/2". Use uma dose de anestesia de 0,01 mL / g de peso corporal. Se o procedimento durar mais de 30 min, mantenha a anestesia injetando 1/3 da dose inicial a cada 30 min.
2. Examine a profundidade do anestésico avaliando o relaxamento muscular, a retirada do pé e os reflexos palpebrais. Quando for observada perda de reflexos, raspe a parte inferior do abdômen do animal.
3. Cubra cuidadosamente os olhos do animal com pomada oftálmica veterinária usando um cotonete estéril para evitar a cegueira devido à falta de reflexo da córnea.
4. Limpe o abdômen raspado com etanol 70% e iodopovidona 10% para desinfetar a área cirúrgica. Esfregue a área cirúrgica do centro da área cirúrgica em direção à periferia.
5. Realize uma incisão vertical na pele na linha média abdominal baixa de aproximadamente 1 cm usando uma tesoura cirúrgica estéril.
6. Levante o peritônio usando uma pinça de ponta fina para evitar danificar os órgãos que estão por baixo. Faça cuidadosamente uma incisão de <8 mm usando tesoura cirúrgica através do peritônio.
   NOTA: Em contraste com os humanos, a próstata de um roedor compreende quatro lobos separados. O lobo anterior está ligado à vesícula seminal.
7. Mova suavemente o tecido adiposo para o lado para descobrir a vesícula seminal. Usando uma pinça de anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até que a próstata anterior possa ser identificada (Figura 1).
8. Injete um volume total de 30 μL de solução de vírus (3 x 10 ¹ ⁰ partículas virais) no epitélio anterior da próstata usando uma seringa de insulina de 0,5 mL com uma agulha de 30G x 8 mm. Minimize o vazamento e certifique-se de que o fluido seja absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha. Coloque a vesícula seminal de volta na cavidade abdominal.
9. Suturar o peritônio com 2-3 pontos simples interrompidos usando suturas absorvíveis 6-0 com um círculo de 13 mm, 3/8 e uma agulha de ponta cônica.
10. Grampeie a pele com três clipes estéreis de 4,8 x 6,5 mm, levantando a pele com uma pinça para evitar danificar o peritônio.
11. Para melhor recuperação, aplique o antídoto anestésico na dose de 0,01 mL/g de peso corporal por injeção intraperitoneal usando uma seringa estéril de 1 mL e uma agulha de 27G x 1/2". Coloque cuidadosamente o animal de volta em sua gaiola.

Resultados

Figura 1: Ilustração do procedimento. O procedimento é realizado no camundongo Rosa26-LSL-Cas9-EGFP gerado por Platt et al. A próstata anterior (AP) está ligada à vesícula seminal (VS). Partículas de vírus que expressam RNA guia e uma proteína Cre são injetadas na próstata anterior para alterar a expressão gênica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J camundongos	O Laboratório Jackson	Rolamento 26175
Seringa de insulina U-100 de 0,5 ml	Bd	324825	para injeção de vírus
Seringa de 1 ml	Bd	300013	para injeção de anestesia
30 G 1/2 '' agulha	Bd	Rolamento 304000	para injeção de anestesia
6-0 Sutura Polysorb	Medtronic	GL889	para fechar o peritônio
Campo cirúrgico esterilizado descartável	Vários fornecedores
Almofada de aquecimento	Vários fornecedores
Almofada de preparação de iodo-povidona	Fisher Científico	06-669-70
Máquina de corte	Aesculap	GT415	para depilar o abdômen
Fórceps Dumont	F.S.T	11252-00
Porta-agulhas Halsey Micro	F.S.T	12500-12
Tesoura de íris	F.S.T	14094-11
Fórceps de padrão estreito	F.S.T	11002-12
Fórceps de anel	F.S.T	11106-09
Punho do sistema de clipe de ferida incl. Clipes	F.S.T	12030-01	para fechar a pele
Removedor de Sistema de Clipe de Ferida	F.S.T	12030-04
1x PBS	Gibco	10010-023
Anti-sedan			obtido do biotério
Butorfanol			obtido do biotério
Medetomidinacloridrato			obtido do biotério
Midazolam			obtido do biotério
100% Etanol	Fisher Científico	22-032-103
Pomada para os olhos	Takeda	Nº 7242
Vírus (AAV, AV)	Vários fornecedores		vírus usado neste protocolo é uma produção interna