Modelagem do câncer de próstata em modelos de camundongos geneticamente modificados: uma técnica de edição de genes localizada mediada por CRISPR/Cas9 em células do lobo anterior da próstata de camundongos

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Entrega de vírus à próstata murina

1. Anestesiar o animal por injeção intraperitoneal com uma seringa estéril de 1 mL e uma agulha de 27G x 1/2". Use uma dose de anestesia de 0,01 mL / g de peso corporal. Se o procedimento durar mais de 30 min, mantenha a anestesia injetando 1/3 da dose inicial a cada 30 min.
2. Examine a profundidade do anestésico avaliando o relaxamento muscular, a retirada do pé e os reflexos palpebrais. Quando for observada perda de reflexos, raspe a parte inferior do abdômen do animal.
3. Cubra cuidadosamente os olhos do animal com pomada oftálmica veterinária usando um cotonete estéril para evitar a cegueira devido à falta de reflexo da córnea.
4. Limpe o abdômen raspado com etanol 70% e iodopovidona 10% para desinfetar a área cirúrgica. Esfregue a área cirúrgica do centro da área cirúrgica em direção à periferia.
5. Realize uma incisão vertical na pele na linha média abdominal baixa de aproximadamente 1 cm usando uma tesoura cirúrgica estéril.
6. Levante o peritônio usando uma pinça de ponta fina para evitar danificar os órgãos que estão por baixo. Faça cuidadosamente uma incisão de <8 mm usando tesoura cirúrgica através do peritônio.
   NOTA: Em contraste com os humanos, a próstata de um roedor compreende quatro lobos separados. O lobo anterior está ligado à vesícula seminal.
7. Mova suavemente o tecido adiposo para o lado para descobrir a vesícula seminal. Usando uma pinça de anel, levante cuidadosamente a vesícula seminal até que a próstata anterior possa ser identificada (Figura 1).
8. Injete um volume total de 30 μL de solução de vírus (3 x 10 ¹ ⁰ partículas virais) no epitélio anterior da próstata usando uma seringa de insulina de 0,5 mL com uma agulha de 30G x 8 mm. Minimize o vazamento e certifique-se de que o fluido seja absorvido dentro do tecido, formando uma pequena bolha. Coloque a vesícula seminal de volta na cavidade abdominal.
9. Suturar o peritônio com 2-3 pontos simples interrompidos usando suturas absorvíveis 6-0 com um círculo de 13 mm, 3/8 e uma agulha de ponta cônica.
10. Grampeie a pele com três clipes estéreis de 4,8 x 6,5 mm, levantando a pele com uma pinça para evitar danificar o peritônio.
11. Para melhor recuperação, aplique o antídoto anestésico na dose de 0,01 mL/g de peso corporal por injeção intraperitoneal usando uma seringa estéril de 1 mL e uma agulha de 27G x 1/2". Coloque cuidadosamente o animal de volta em sua gaiola.

Figura 1: Ilustração do procedimento. O procedimento é realizado no camundongo Rosa26-LSL-Cas9-EGFP gerado por Platt et al. A próstata anterior (AP) está ligada à vesícula seminal (VS). Partículas de vírus que expressam RNA guia e uma proteína Cre são injetadas na próstata anterior para alterar a expressão gênica.