Extração de rim intacto de camundongo: uma técnica para obter rim sem cápsula renal de modelos murinos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Grainger, N. et al. Isolando e Visualizando Regiões de Marcapasso Intactas e Vivas da Pelve Renal de Camundongos por Seccionamento de Vibratomo. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de extração renal do espaço retroperitoneal do camundongo. O rim extraído pode ainda ser microdissecado para obter um rim intacto sem cápsula renal e a camada de gordura circundante.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecção renal

Anestesiar camundongos por inalação de isoflurano a 3–4% em um exaustor ventilado. Confirme a indução de anestesia profunda por perda do reflexo de pinça do dedo do pé e/ou cauda e, em seguida, eutanasiar os camundongos por luxação cervical.
Aplique etanol 70% no peito para umedecer o pelo. Usando uma tesoura de dissecção externa, abra a cavidade abdominal por meio de uma incisão longitudinal, com as lâminas da tesoura inclinadas para longe do animal para evitar danos aos órgãos internos.
Usando uma pinça de tecido interno e uma tesoura de dissecção interna, aperte os intestinos e afaste-os da parede abdominal. Enquanto levanta os intestinos, corte a parte inferior dos intestinos do corpo no duodeno proximal e no cólon distal para obter acesso ao espaço retroperitoneal que contém os rins.
Uma vez que os rins estejam expostos, extraia-os individualmente. Aperte e levante suavemente a extremidade distal do ureter (~ 4 mm de distância do rim) com uma pinça de tecido. Usando a tesoura de dissecação, corte embaixo do ureter comprimido em direção ao rim. Continue a cortar embaixo do rim até que ele seja liberado do tecido conjuntivo circundante.
nota: Para maximizar a integridade do tecido e a consistência do corte durante a secção do vibratomo, o rim deve estar o mais intacto possível. Para garantir isso, evite beliscar ou cortar o rim com pinças e tesouras de dissecção.
Coloque o rim com o ureter conectado em uma solução KRB gelada. Repita as etapas de extração com o rim contralateral para remover do corpo do camundongo. Manter os rins em solução de KRB em gelo.
NOTA: Prossiga imediatamente para a próxima seção do protocolo para preservar a viabilidade do tecido PKJ. Devido à sua localização anatômica profunda no parênquima renal, a PKJ é privada de contato com a solução de KRB.

2. Prepare o rim sem cápsula renal para seccionamento de vibratome

Transferir o rim para uma placa de dissecção revestida com elastómero de silicone (60 mm x 15 mm) e enchê-lo com uma solução de KRB gelada até que o rim esteja completamente submerso.
Sob um microscópio de dissecação, ancore o rim à base da placa inserindo pinos minucianos no ureter proximal e através da fina cápsula renal anterior ou tecido adiposo circundante.
nota: Tome cuidado para não perfurar o tecido do parênquima renal.
Use uma tesoura de mola fina e uma pinça interna para remover o tecido adiposo da base do rim para expor o FR distal e o ureter proximal.
Remova o ureter proximal e uma parte do FR distal da base do FR usando uma tesoura de mola fina.
nota: Tome cuidado para não cortar o parênquima renal circundante. A linha tracejada preta na Figura 1A indica a posição aproximada desse corte. Este corte cria uma base plana no rim para uma secção de tecido mais uniforme. Ao dissecar o rim, deve-se estar atento à posição anatômica da região da JPJ. A Figura 1B mostra que o rim íntegro pode ser cortado ao longo de um plano sagital para expor a medula, papila (medula distal onde convergem os ductos coletores) e FR proximal e distal. Se a papila for exposta completamente, como na Figura 1C, a PKJ e o FR proximal (PR de proximidade) podem ser visualizados. No entanto, isso não deve ser feito para a técnica do vibratomo; esta descrição é para orientar o leitor para a localização da PKJ em geral, enfatizada na diferença anatômica mostrada nas imagens de luz transmitida da região PKJ e da região média de RP na Figura 1D, E.
Perfure a cápsula renal externa com uma pinça de ponta fina, inclinando as pontas para longe do corpo do rim. Usando uma pinça com cada mão, aperte as pontas soltas da cápsula e separe-as. Continue a descascar a membrana da cápsula renal restante até que ela seja totalmente removida.
nota: A cápsula renal é uma camada fibrosa e resistente que envolve o rim. Deve ser removido antes do seccionamento do vibratomo para um corte ideal.

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Resultados

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Figura 1: Anatomia renal básica e localização da região do marcapasso PKJ.(A) Diagrama do rim intacto mostrando a orientação do FR e do ureter. A artéria renal e a veia renal são exibidas em vermelho e azul, respectivamente. (B) O rim intacto pode ser cortado ao longo de um plano sagital para expor o aspecto interno do rim, incluindo a medula, papila (medula distal o...