Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparar soluções
- Prepare 1 L de solução de bicarbonato de Krebs-Ringer (KRB) contendo 120,35 mM de NaCl, 5,9 mM de KCl, 15,5 mM de NaHCO3, 1,2 mM de Na2HPO 4,1,2 mM de MgCl2, 11,5 mM de glicose e 2,5 mM de CaCl2. No dia do uso, mantenha a solução KRB no gelo.
nota: O KRB pode ser armazenado a 4 °C por até uma semana e deve ser pré-borbulhado com uma mistura de 97% de O2 e 3% de CO2 por pelo menos 10 min antes do uso.
2. Secção do Vibratome do Rim
- Use uma pinça de ponta romba para agarrar e remover suavemente o rim preparado da solução KRB gelada. Coloque imediatamente o rim em papel absorvente por ~ 2–4 s para remover o excesso de umidade externa. Role suavemente o rim sobre o papel absorvente para garantir que todos os lados do parênquima tenham secado, de modo que haja uma adesão ideal do rim ao estágio de vibrato.
NOTA: Como a pelve renal está localizada dentro do rim e, portanto, protegida pelo parênquima externo, esse curto período de secagem não prejudicaria a integridade do tecido.
- Aplique imediatamente uma fina camada de cola de cianoacrilato (~ 1 cm2) na base da placa da amostra do vibratomo e use uma pinça de ponta romba para colocar o rim, com o lado do ureter voltado para baixo, na área coberta de cola. Aplique suavemente a pressão para baixo na parte superior do rim com a borda plana da pinça por aproximadamente 10 a 20 s para secar a cola.
nota: Para estabilizar o rim durante este procedimento, use um par adicional de pinças para manter o rim na posição vertical enquanto a cola seca. É fundamental que o rim adira à placa da amostra na posição vertical para que as seções sejam cortadas retas. Para garantir que o rim tenha aderido com sucesso à placa de amostra, empurre suavemente a lateral do rim. Se o rim aderiu com sucesso à placa, a base do rim deve permanecer presa à placa.
- Prenda firmemente a placa de amostra na parte inferior da bandeja tampão. Ajuste o nível da solução KRB para que a parte superior do rim fique totalmente imersa. Durante as etapas de seccionamento, à medida que a lâmina do vibratomo se move mais profundamente na bandeja do buffer, remova a solução KRB para que o porta-lâmina não fique imerso na solução.
nota: Se a cola não tiver secado completamente antes de prosseguir com esta etapa, a cola geralmente subirá da base e entrará no parênquima renal. Esse excesso de cola tornará o seccionamento mais variável. Se isso acontecer, remova o rim da placa e prossiga com uma nova preparação renal.
- Para seccionamento automático do vibratomo, selecione as posições inicial e final do ciclo de corte da lâmina do vibrato. Verifique se essas posições estão ~ 0.5–1 cm fora do rim para garantir que, a cada avanço da lâmina, todo o plano do rim seja seccionado.
- Prepare uma placa de vários poços (24 ou 48 poços) enchendo os poços com solução KRB e coloque a placa no gelo.
nota: Quando geradas, as seções individuais devem ser colocadas em poços separados para acompanhar a profundidade da seção.
- Inicie o processo de corte automático. Durante a passagem inicial da lâmina, certifique-se de que a lâmina entre em contato com a parte superior do rim. Se não houver contato, ajuste a posição Z inicial da lâmina.
- Usando uma pinça, colete as seções que são liberadas do rim. Transfira imediatamente as seções para poços individuais e observe a profundidade Z das seções para medir a localização aproximada da PKJ nas seções renais.
nota: Dependendo dos parâmetros de corte, algumas seções podem não ser cortadas sem o bloqueio renal. Se isso ocorrer, use cuidadosamente uma tesoura de mola fina para cortar seções do bloqueio renal. Os usuários também são incentivados a visualizar ativamente as seções sob um microscópio de luz enquanto flutuam livremente em poços individuais para garantir as configurações ideais de corte e a localização do tecido. As seções contendo o PKJ normalmente serão derivadas ~ 1000–1500 μm do topo do rim.
- Continue o protocolo de seccionamento até que as regiões PKJ se tornem mais aparentes. Consulte a seção de resultados representativos para obter uma descrição das regiões PKJ à medida que o seccionamento prossegue.
- Neste ponto, otimize os parâmetros de seccionamento para garantir que os cortes sejam liberados do bloqueio renal uniformemente e estejam intactos. Além disso, certifique-se de que as regiões PKJ sejam contínuas e ininterruptas, pois as paredes PKJ quebradas não permitirão imagens adequadas das células dentro da parede devido ao colapso. Se as paredes se quebrarem, diminua a velocidade de corte e aumente a espessura da seção e continue a observar as seções sob um microscópio óptico para ajustar os parâmetros de corte.
- Armazenar seções a 4 ° C em solução KRB até o início da experimentação.
