Modelo de Organoide de Tumor de Bexiga: Um Método para Transplante Ortotópico de Organoides de Bexiga para Bexiga Murina Receptora

Resumo

Fonte: Kim, Y. et al. Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides de Tumor de Bexiga de Camundongo.J. Vis. Exp.(2020)

Neste vídeo, descrevemos o transplante ortotópico de organoides tumorais de bexiga cultivados para a bexiga murina para estudar o papel do ambiente do órgão no desenvolvimento de tumores.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Subcultura de Organoides de Tumor de Bexiga
 

NOTA: Recomenda-se a passagem de organoides de tumor de bexiga quando atingirem 100–150 μm de diâmetro.

1. Adicione 500 μL de colagenase / dispase ao meio organoide em uma placa de 24 poços com organoides tumorais. Pipete para cima e para baixo na matriz da membrana basal e no meio. Incubar por 20 min a 37 °C e colher as células em um tubo de 15 mL.
   nota: Examine os organoides isolados da matriz da membrana basal ao microscópio. Se os organoides não estiverem separados da matriz da membrana basal, aumente o tempo de incubação ou pipete mais vezes.
2. Adicione 5 mL de DMEM pré-aquecido, centrifugue o tubo a 400 x g por 3 min a 4 °C e aspire o sobrenadante.
3. Ressuspenda o pellet usando 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido e 10 μM Y-27632. Incubar durante 5 min em banho-maria a 37 °C. Pipetar vigorosamente as células para cima e para baixo e neutralizar a tripsina usando 5 mL de DMEM com 10% de FBS.
4. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
5. Ressuspenda o pellet usando 1 mL de meio organoide pré-aquecido e conte o número de células tumorais únicas.

2. Transplante ortotópico de organoide de bexiga (Figura 1A)

1. Prepare os organoides tumorais da bexiga para transplante ortotópico
   1. Antes do transplante, cultive os organoides do tumor da bexiga por 5 a 7 dias, conforme descrito acima.
   2. Adicione 500 μL de colagenase / dispase ao meio organoide em uma placa de 24 poços com os organoides tumorais. Pipete para cima e para baixo na matriz da membrana basal e no meio. Incubar durante 20 min a 37 °C e recolher as células para um tubo de 15 ml.
   3. Adicionar 5 ml de DMEM pré-aquecido, centrifugar o tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante.
   4. Ressuspender o sedimento com 1 ml de DMEM e transferir a solução para uma placa de Petri de 90 mm.
   5. Sob um microscópio, pegue os 10 a 100 organoides tumorais usando uma micropipeta P200 e colete-os em um microtubo no gelo.
   6. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 3 min a 4 °C e rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
   7. Mantenha o pellet celular no gelo até que os camundongos estejam prontos para a cirurgia.
2. Transplante de parede da bexiga submucosa
   1. Prepare um camundongo nu macho de 8 a 10 semanas de idade (CAnN.Cg-Foxn1nu / Crl) pelo menos 1 semana antes do experimento para permitir que ele se acostume a um novo ambiente. Injete enrofloxacina (5 mg/kg) por via subcutânea 24 h antes da cirurgia.
   2. Limpe a superfície da bancada com água e sabão. Autoclave os instrumentos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico e realize a cirurgia usando instrumentos estéreis.
   3. Mantenha a seringa de insulina de 29 G, as pontas da pipeta e a matriz da membrana basal no gelo. Administre cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea antes da administração da anestesia.
   4. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 4% em uma câmara de indução. Uma vez alcançada a anestesia geral, coloque o camundongo em decúbito dorsal e mantenha a anestesia por inalação de máscara de isoflurano vaporizado a 2%
      nota: Se o tempo de anestesia for superior a 30 min, aplique pomada ocular em ambos os olhos usando um cotonete para evitar o ressecamento da córnea.
   5. Aplique iodopovidona com gaze estéril e limpe-a com etanol a 70%. Repita 3x com uma nova gaze ou cotonete a cada vez.
   6. Cubra o ânus e o campo cirúrgico usando campos cirúrgicos descartáveis e estéreis.
   7. Usando um microscópio de dissecação para ampliação, faça uma pequena incisão transversal (menor que 1,5 cm) na pele e na parede muscular da linha média inferior do abdômen com tesoura cirúrgica estéril. Exponha a bexiga da cavidade abdominal e apoie-a com cotonetes embebidos em solução salina.
      nota: Se a bexiga estiver cheia de urina, pressione suavemente a bexiga para descomprimi-la ligeiramente.
   8. Ressuspenda os grânulos organoides em 80 μL de meio organoide contendo 50% de matriz de membrana basal de alta concentração (Tabela 1 e Tabela de Materiais).
   9. Injetar a suspensão organoide na face anterior da cúpula da bexiga utilizando a seringa de insulina 29 G ao microscópio de dissecação.
   10. Feche a camada interna da parede abdominal com sutura absorvível antibacteriana e, em seguida, feche a camada externa com sutura de náilon 4-0. Desinfetar o sítio cirúrgico com iodopovidona e etanol a 70%.
   11. Deixe o mouse se recuperar sob um irradiador infravermelho por 10 a 15 min. Monitore o mouse até que ele recupere a consciência e a motilidade.
   12. Um dia após a cirurgia, verifique o estado geral do camundongo e o vazamento da anastomose. Administre cetoprofeno (5 mg / kg) uma vez ao dia por 3 dias no pós-operatório e trate a enrofloxacina (5 mg / kg) uma vez ao dia por 10 dias no pós-operatório.
   13. Quando o local da incisão estiver cicatrizado (10 a 14 dias após a cirurgia), remova as suturas. Monitore o crescimento do tumor da bexiga do camundongo por 2 a 3 semanas após a injeção do organoide tumoral.
   14. Se for observado crescimento de tumor de bexiga, eutanasiar o camundongo usando inalação de dióxido de carbono e colher todo o tumor de bexiga. Lave-o usando DPBS frio (Figura 1B).
   15. Para analisar a histologia do tumor de bexiga, corar a seção embebida em parafina do tecido usando coloração de hematoxilina e eosina (H&E) (Figura 1B).

Meio organoide de tumor de bexiga de camundongo
DMEM/F-12 avançado (médio básico)	HEPES 10 mM (pH 7,4)
10 mM de nicotinamida	0,5x Suplemento sem soro
2 mM de dipeptídeo de L-alanil-L-glutamina	1% de penicilina/estreptomicina
N-acetil-L-cisteína 1 mM	50 ng/mL Fator de crescimento epidérmico murino
1 μM A 83-01

Tabela 1: Composição do meio organoide do tumor de bexiga.

Resultados

Figura 1: Transplante ortotópico de organoides tumorais de bexiga.(A) Diagrama esquemático de transplante ortotópico de organoides tumorais de bexiga para um camundongo nu. (B) Imagens representativas de bexigas e seções coradas com H & E de camundongos transplantados ortotopicamente com organoides de tumor de bexiga. As vistas ampliadas das regi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo cônico de 15 mL	Spl	50015
Placa de 24 poços	Corning	3526
Seringa de insulina 29 G 1/2	Shina	B299473538
Tubo cônico de 50 mL	Spl	Rolamento 50050
Rolamento A8301	Tocris	Nº 2939	Concentração de estoque: 25 mM
Etanol absoluto	Daejung	Rolamento 4023-2304
Sutura absorvível	Henry Schein	Rolamento 039010
DMEM/F-12 avançado	Thermo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (rato nu)	Rio Charles	194
Colagenase tipo I	Thermo	17100017	Concentração de estoque: 20 mg/mL
Colagenase tipo II	Thermo	17100015	Concentração de estoque: 20 mg/mL
Colagenase/dispase	sigma	10269638001	Concentração de estoque: 1 mg/mL
DMEM (meios essenciais mínimos modificados de Dulbecco)	Gibco	11965-118
DMSO (dimetilsulfóxido)	sigma	D8418
DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)	Welgene	LB 001-02
Fator de crescimento de Matrigel reduzido (TFG) Fator de crescimento reduzido (TFG)	Corning	Rolamento 354230	Uso para cultura organoide em placa
Matrigel de alta concentração (HC)	Corning	354248	Uso para transplante de organoides
Microtubo de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Lâmina
Tampão salino	JW Farmacêutica
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072
Tubo de ultracentrifugação	Beckman Coulter	331372
Cloridrato de Y-27632	Abmole	M1817	Concentração de estoque: 10 mM