Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação de Sondas
- Preparar sondas de liga de titânio-níquel (40 mm de comprimento; 0,2 mm de diâmetro) revestidas com um adsorvente de modo misto de 7 mm. O número de sondas depende dos pontos de tempo visados durante todo o procedimento e do número de réplicas (3 são recomendadas por ponto de tempo).
nota: A duração e o tipo de fase de extração podem ser ajustados com base no modo de estudo, na polaridade dos metabólitos e na matriz da amostra.
- Prepare uma mistura de limpeza composta de clorofórmio:metanol 2:1 (v/v). Pipetar 1,0 mL da solução para cada frasco de vidro de 2,0 mL e colocar uma sonda, previamente perfurada através da tampa, em cada frasco.
nota: Antes de usar, limpe todas as sondas para remover partículas contaminantes.
- Coloque os frascos no agitador e ajuste a velocidade de agitação em 1.200 rpm. Após 45 min, pare o dispositivo e enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS.
- Como os revestimentos devem passar por uma etapa de pré-condicionamento para ativá-los, prepare uma mistura de pré-condicionamento composta de metanol:água 1:1 (v/v). Pipetar 1,0 ml da solução para cada frasco de vidro de 2,0 ml e colocar uma sonda, previamente perfurada através da tampa, em cada frasco para injetáveis.
- Coloque os frascos no agitador de vórtice e ajuste a velocidade de agitação em 1.200 rpm.
- Após 60 min, pare o agitador e enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS.
- Esterilize as sondas de acordo com o protocolo padrão de esterilização do equipamento cirúrgico.
2. Extração
- Abra a embalagem estéril logo antes da amostragem para garantir um ambiente estéril.
- Insira duas sondas diretamente no córtex renal por 10 minutos em cada ponto de tempo. Todo o comprimento do revestimento deve ser coberto pela matriz tecidual; Nenhum ângulo específico é necessário, mas cerca de 90 graus é geralmente usado.
nota: Todo o procedimento médico segue protocolos padrão em uma determinada instituição. Nenhuma modificação relativa à amostragem de SPME é considerada. O procedimento envolve os seis seguintes momentos de amostragem: a) antes da ressecção renal, in vivo do doador; b)–e) após 1 h, 3 h, 5 h, 7 h de perfusão renal, ex vivo em câmara de órgãos; f) após a reperfusão, in vivo do receptor.
- Retraia as sondas puxando-as para fora do tecido e, em seguida, enxágue os revestimentos com água de grau LC-MS para limpar qualquer sangue restante da superfície do revestimento. Enxágue fora do local da cirurgia e imediatamente após a remoção das sondas.
3. Transporte e armazenamento
- Coloque as sondas em frascos separados e feche-os.
- Coloque os frascos em uma caixa de isopor cheia de gelo seco ou nitrogênio líquido para transporte.
- Armazene as amostras em um freezer (-80 °C) ou inicie imediatamente a etapa de dessorção.
4. Dessorção
- Preparar soluções de dessorção compostas por acetonitrila:água (v/v) 80:20 para análise metabolômica e isopropanol:metanol 1:1 (v/v) para análise lipidômica.
- Pipete 100 μL da solução para inserções colocadas em frascos marcados com 2,0 mL e coloque uma sonda, previamente perfurada na tampa, em cada frasco.
- Coloque os frascos no agitador de vórtice e ajuste a velocidade de agitação em 1.200 rpm por 120 min.
- Remova as sondas dos frascos. Os extratos obtidos estão agora prontos para análise instrumental.
5. Análise LC-MS
- Colocar frascos contendo extratos no amostrador automático do sistema LC-MS.
nota: Cromatografia líquida (RP, HILIC) acoplada à espectrometria de massa de alta resolução e um analisador de massa orbitrap foram usados para este estudo. Para parâmetros de análise metabolômica, vá para a etapa 5.2. Para parâmetros de análise lipidômica, vá para a etapa 5.6.
- Use uma coluna de pentafluorofenil (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) para separação de fase reversa.
- Defina a vazão para 300 μL/min e as temperaturas do amostrador automático e da coluna para 4 °C e 25 °C, respectivamente.
- Preparar fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: água: ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) e fase móvel B: acetonitrila:ácido fórmico (99,9:0,1, v/v). Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: fluxo de fase móvel inicial (0–3 min): 100% A seguido por um gradiente linear para 10% A (3–25 min), terminando com o fluxo isocrático de 10% A até 34 min, seguido por 6 min de tempo de reequilíbrio da coluna.
- Para separação HILIC, use uma coluna HILIC (2.0 mm x 100 mm, 3 μm, 200A). Defina a taxa de fluxo para 400 μL/min.
- Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: acetonitrila: tampão acetato de amónio (9:1, v/v, concentração efetiva de sal 20 mM), fase móvel B: acetonitrila:tampão acetato de amónio (1:1, v/v, concentração efetiva de sal 20 mM).
- Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: inicie o fluxo de fase móvel (0–3 min) a 100% A, segure por 3.0 min e depois aumente para 100% B em 5 min. Mantenha com 100% B até 12 min, seguido por 8 min de tempo de reequilíbrio da coluna.
- Defina a faixa de varredura para 85–1000 m/z. Defina os parâmetros da fonte de íons HESI no modo de ionização positiva para: tensão de pulverização 1,500 V, temperatura capilar 300 °C, gás da bainha 40 u.a., vazão de gás auxiliar 15 u.a., temperatura do aquecedor da sonda 300 °C, nível de RF da lente S 55%.
- Execute amostras de CQ compostas por 10 μL de cada amostra analisada (regularmente, a cada 10 a 12 amostras) para monitorar o desempenho do instrumento.
- Para a separação de fase reversa, use uma coluna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
- Defina a vazão para 200 μL/min e as temperaturas do amostrador automático e da coluna para 4 °C e 55 °C, respectivamente. Preparar fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A: H2O:MeOH (60:40, v/v), acetato de amónio 10 mM e ácido acético 1 mM; fase móvel B: IPA:MeOH (90:10, v/v), acetato de amônio 10 mM e ácido acético 1 mM.
- Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: 0–1 min (20% B), 1–1.5 min (20–50% B), 1.5–7.5 min (50–70% B), 7.5–13 min (70–95% B), 13–17 min (95% B), 17–17.1 min (95–20% B), 17.1–23 min (20%).
- Para a separação HILIC, use uma coluna HILIC (100 x 2.1 mm, 3 μm).
- Defina a vazão para 400 μL/min e as temperaturas do amostrador automático e da coluna para 4 °C e 40 °C, respectivamente.
- Preparar as fases móveis de acordo com as seguintes proporções: fase móvel A:ACN; fase móvel B: acetato de amónio 5 mM em água. Defina o fluxo de fase móvel de acordo com os seguintes parâmetros: 0–2 min (96% B), 2–15 min (96–80% B), 15–15.1 min (80–96% B), 15.1–21 min (96% B).
- Defina os parâmetros da fonte de íons HESI no modo de ionização positiva para tensão de pulverização de 3.500 V, temperatura capilar de 275 °C, gás de bainha de 20 uA, taxa de fluxo de gás auxiliar de 10 uA, temperatura do aquecedor da sonda de 300 °C, nível de RF da lente S de 55%.
- Execute amostras de CQ compostas por 10 μL de cada amostra analisada (a cada 10 a 12 amostras) para monitorar o desempenho do instrumento.
- Realizar aquisição de dados em software compatível com o instrumento.
6. Análise de dados
- Realizar processamento de dados, identificação putativa e análise estatística usando software dedicado à metabolômica não direcionada e análise lipidômica.
nota: A análise de componentes principais (PCA) e os gráficos de bigode de caixa podem ser obtidos para visualizar a estrutura dos dados.
