Coloração de DNA extracelular: um método para identificar DNA extracelular em seções de tecido FFPE

Resumo

Fonte: O'Sullivan, K. M. et al. Aprendizado de máquina supervisionado para semi-quantificação de DNA extracelular na glomerulonefrite. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve a técnica de coloração de DNA extracelular em seções de tecido FFPE. O DNA extracelular corado pode ser quantificado para determinar a eficácia de qualquer tratamento terapêutico que leve à morte de células cancerígenas.

Protocolo

1. Coloração para ecDNA com DAPI e β-Actina

1. Coloque as lâminas de vidro em uma grade deslizante em um forno a 60 ° C por 60 min.
2. Mergulhar as lâminas em duas mudas de solvente (xileno ou substituto) durante 40 min cada, numa hotte.
3. Reidrate as lâminas em 100% de etanol, 100% de etanol e 70% de etanol por 5 min cada. Lave por 5 min em água da torneira.
4. Coloque uma placa quente em uma capela de exaustão e pré-ferva a solução de recuperação de antígeno (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9,0) em uma panela de pressão. Assim que a solução de recuperação de antígeno começar a ferver, coloque as lâminas na panela horizontalmente usando uma pinça e trave a tampa. Ferva em alta (equivalente a 15 psi ou 103 kPa) por 10 min.
   nota: Esta etapa é crucial, pois recupera o antígeno de interesse desmascarando o epítopo do antígeno (reticulado via fixação de formalina) para permitir a ligação específica do anticorpo do epítopo; a coloração subsequente não funcionará sem ele.
5. Retire a panela de pressão do fogo e remova a tampa imediatamente, passando a torneira fria em cima da tampa de uma pia. Deixar as lâminas em equilíbrio durante 20 min na solução de recuperação de antigénio.
6. Lave as lâminas duas vezes por 5 min em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 M (pH 7,4) em um agitador orbital.
7. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor do tecido renal, tomando cuidado para não deixar nenhum tecido secar nesse período.
8. Bloqueie o tecido em soros de galinha a 10% em albumina de soro bovino (BSA) / PBS a 5% (pH 7,4, 0,01 M) por 30 min, 60 μL por seção. Não lave após esta etapa, mas remova cuidadosamente a solução de bloqueio usando uma pipeta de 60 μL, não deixe as seções secarem.
9. Aplique o coquetel de anticorpos primários para β-actina diluída a 1/1000 em 1% BSA / PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL por seção e incube durante a noite em uma câmara de umidade a 4 ° C.
10. Lave as lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
11. Aplique anticorpo secundário, anti-coelho de frango 488 (1/200), 60 μL por seção diluído em 1% BSA / PBS (pH 7,4, 0,01 M) por 40 min em RT.
12. Lave as lâminas duas vezes por 5 min em PBS (pH 7,4, 0,01 M) em um agitador orbital.
13. Mergulhe as lâminas em Sudan Black 0,3% em etanol 70% por 30 min em um frasco Coplin.
    nota: Esta etapa é importante, pois extingue a autofluorescência causada pela fixação da formalina.
14. Lave as lâminas em água da torneira para remover o precipitado e, em seguida, mergulhe em PBS (pH 7,4, 0,01 M) por 10 min para evitar a formação de mais precipitado de Sudan Black.
15. Monte as lâminas em lamínulas de vidro confocais usando três gotas de 60 μL de solução de montagem com DAPI e sele as lamínulas com esmalte aplicando em todo o perímetro da lamínula.
16. Deixar as lâminas catalisarem durante 24 horas em RT (para permitir a penetração do DAPI) e conservar a 4 °C ao abrigo da luz.
    nota: Importante manter no escuro para evitar o desbotamento das sondas fluorescentes.
17. A imagem desliza usando uma cabeça de varredura a laser confocal conectada a um microscópio. Excite os slides com o laser 405 para DAPI e o laser 488 para Beta Actin. Capture imagens de plano único de 1024 x 1024 pixels usando captura sequencial de linha e média de 4 linhas, o que é essencial para detectar ecDNA. 40x 1,0 NA objetiva de óleo é usada.
    1. Imagem de um mínimo de 20 glomérulos por amostra. Salve imagens como arquivos ND2.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina de soro bovino	sigma	A2153	As soluções de 5% e 1% são feitas em PBS, podem ser feitas a granel e congeladas - descarte depois de descongeladas
Anticorpo de absorção cruzada IgG de cabra (H + L) de frango Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Gire na mini centrífuga por 1 minuto antes de usar para evitar qualquer conjugado livre em seu coquetel de anticorpos
Anticorpo de absorção cruzada de IgG (H + L) de camundongo anti-frango, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Gire na mini centrífuga por 1 minuto antes de usar para evitar qualquer conjugado livre em seu coquetel de anticorpos
Anticorpo de absorção cruzada IgG (H+L) anticorpo de absorção cruzada Alexa Fluor 488 de frango anti-coelho	ThermoFisher Scientific	A-21441	Gire na mini centrífuga por 1 minuto antes de usar para evitar qualquer conjugado livre em seu coquetel de anticorpos
Soro de galinha	sigma	C5405	Feito em 1% BSA / PBS
Lamínulas 24x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Esta não é uma espessura padrão projetada para uso em microscopia confocal
EDTA 10mM	sigma	E6758	Adicione TRIS e EDTA juntos em água destilada e pH a 9, para recuperação de antígeno, pode ser feito em uma solução 10x
Etanol 30%, 70% e 100%	Fornecimento de produtos químicos	UN1170	Fornecido como etanol 100% não desnaturado - diluir a 30% e 70% usando água destilada
Formaldeído, 4% (10% de formalina tamponada neutra)	Trajano	NBF-500	O rim é colocado em um tubo de 5ml contendo 3ml de formalina por 16 horas em RT, a formalina deve ser usada em um exaustor
Lâminas de histologia de vidro - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0mm	Trajano	J3800AM4	O uso de lâminas revestidas com carga positiva é essencial. Não recomendamos o uso de poli-L-lisina para revestir lâminas, pois o tecido se desprende das lâminas durante a etapa de recuperação do antígeno
Anticorpo MPO anti-humano / camundongo de cabra	R&d	AF3667	Alíquota e congelamento a 80 graus negativos na chegada
Caneta hidrofóbica	Laboratórios VECTOR	H-400	Use para desenhar círculo ao redor do tecido renal
Solução salina tamponada com fosfato	sigma	Pág. 38135	0,01 M PB / 0,09% NaCl compõem 5L de cada vez
Panela de Pressão 6L Tefal secure 5 Neo inox	Tefal	GSA-P2530738	Comprado em loja local de artigos para o lar
Prolongar DAPI de ouro	Tecnologias da Vida	Pág. 36962	Aplique gotas diretamente na lamínula
Anticorpo anti-actina beta humana / de camundongo de coelho	ABCAM	AB8227	Alíquota e congelamento a 80 graus negativos na chegada
Anticorpo H3Cit anti-humano / camundongo de coelho	ABCAM	AB5103	Alíquota e congelamento a 80 graus negativos na chegada
Grelha de coloração 24 lâminas	ProScitech	H4465	A cremalheira de coloração escolhida deve ser capaz de suportar a ebulição sob pressão e incubação em forno de 60 graus
Sudão Preto B	sigma	199664	0,3% Adicione 3g a uma garrafa de 1L em etanol 70%, filtre e proteja da luz - estável por 6 meses em temperatura ambiente
Tris 10mM	sigma	T4661	Adicione TRIS e EDTA juntos em água destilada e pH a 9, para recuperação de antígeno, pode ser feito em uma solução 10x
xileno	Trajano	XL005/20	Deve ser usado em uma hotte