Derivação de podócitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas: um procedimento para diferenciação direcionada de podócitos renais maduros de células-tronco

1. Preparação de reagentes

1. Diluir o suplemento de 5x hiPS descongelado em meio basal de cultura de células hiPS para obter uma solução 1x de hiPS CCM.
   nota: O suplemento de CCM 5x hiPS congelado requer um processo de descongelamento lento, idealmente a 4 °C durante a noite. As alíquotas do 1x hiPS CCM podem ser armazenadas por até 6 meses a -20 °C.
2. Preparação de placas revestidas com matriz de membrana basal (BM) 1 para cultura de células hiPS: Descongele a matriz BM 1 durante a noite em gelo a 4 °C. Depois de descongeladas, preparar alíquotas com fatores de diluição adequados, conforme sugerido pelo fabricante.
   nota: Normalmente, as alíquotas são preparadas para diluição subsequente em 25 mL de DMEM/F12 frio em um tubo cônico de 50 mL, seguida de mistura completa para dissolver completamente a matriz BM 1 e evitar a formação de cristais residuais.
3. Transferir 1 ml da solução de matriz BM 1 para cada alvéolo de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C durante 1–2 h ou a 4 °C durante um mínimo de 24 h, envolto em película de parafina. As placas revestidas com matriz BM 1 podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
4. Preparação de placas revestidas com 2 matrizes de membrana basal (BM): Dilua quantidades apropriadas de matriz BM 2 em 9 mL de água destilada estéril para preparar uma concentração final de 5 μg/mL. Adicionar 700 μl da solução de matriz BM 2 a cada alvéolo de uma placa de 12 poços e incubar a placa à temperatura ambiente durante 2 h ou durante a noite a 4 °C.
5. Prepare soluções estoque de 100 μg / mL de BMP7, Activina A e VEGF da seguinte forma: Reconstitua BMP7 em água destilada estéril contendo 0,1% (peso / vol) de BSA e reconstitua Ativina A e VEGF separadamente em PBS estéril contendo 0,1% (peso / vol) de BSA. Para evitar ciclos frequentes de congelamento e descongelamento, prepare alíquotas de 100 μL de cada solução-mãe e armazene a -20 °C por até 6 meses.
6. Preparar uma solução-mãe a 10 mM de Y27632 dissolvendo 10 mg de Y27632 em 3,079 ml de água destilada estéril. Alíquota 100 μL do estoque e armazenar a -20 °C por até 6 meses.
7. Dissolva 2 mg de CHIR99021 em 143,4 μL de DMSO estéril para preparar uma solução estoque de 30 mM. Prepare alíquotas de 5 μL e armazene a -20 °C por até 1 mês (ou de acordo com a recomendação do fabricante).
8. Dissolva 10 mg de ácido trans-retinóico em 3,33 mL de DMSO estéril. Preparar alíquotas de 500 μL e conservar a -20 °C até 6 meses.

2. Preparação de meios de cultura

1. Prepare o meio de diferenciação do mesoderma reconstituindo as soluções estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL de Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 e 1x suplemento sem soro B27 em um volume apropriado de DMEM/12 com suplemento de glutamina.
   nota: O meio de diferenciação do mesoderma deve ser preparado recentemente antes das etapas de diferenciação e em um volume apropriado para a escala do experimento (normalmente, 50 mL de meio é adequado para duas placas de 12 poços).
2. Prepare o meio intermediário de diferenciação do mesoderma reconstituindo as soluções estoque correspondentes para uma concentração final de 100 ng/mL de BMP7, 3 μM CHIR99021 e 1x suplemento sem soro de B27 em DMEM/F12 com um suplemento de glutamina.
   nota: Se necessário, o meio pode ser suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% (vol / vol). Ajuste o volume do meio usando DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Este meio pode ser preparado em grandes lotes; no entanto, recomenda-se armazenar em alíquotas menores (por exemplo, 45 mL em tubos cônicos de 50 mL) para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Este meio pode ser armazenado a -20 °C por até 3 meses e pode ser descongelado a 4 °C durante a noite antes do uso.
3. Prepare o meio de indução de podócitos reconstituindo até uma concentração final 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL de ativina A, 50 ng/mL de VEGF, 3 μM de CHIR99021, 1x suplemento sem soro B27 e 0,1 μM de ácido all-trans retinóico em DMEM/F12 com suplemento de glutamina. Proteja o meio da luz (por exemplo, embrulhando o recipiente com papel alumínio).
   nota: Este meio pode ser preparado em grandes lotes e armazenado no escuro a -20 °C por até 3 meses. As alíquotas congeladas devem ser descongeladas durante a noite a 4 °C antes da utilização.
4. Prepare 25 mL de solução neutralizante de tripsina adicionando 10% (vol / vol) de FBS inativado por calor em DMEM / F12 e filtre em condições estéreis.
5. Para manutenção pós-diferenciação dos podócitos derivados de células-tronco, prepare o meio completo com meios de manutenção de podócitos adicionando o suplemento ao meio basal de acordo com as diretrizes do fabricante e armazene a 4 ° C por até duas semanas.

3. Cultura de células hiPS sem alimentador usando meio de cultura de células hiPS

1. Aspire a solução residual da matriz BM 1 das placas pré-revestidas e lave os poços 3 vezes com 1 a 2 mL de DMEM/F12 aquecido.
2. Aspire hiPS CCM gasto das células hiPS e enxágue as células 3 vezes com DMEM/F12 aquecido. Adicione 1 ml de solução quente de descolamento de células e incube durante 1 min a 37 °C para ajudar a dissociar as células. Realize a inspeção visual das células sob um microscópio de cultura de tecidos e certifique-se de que as bordas das colônias de células pareçam arredondadas e, em seguida, aspire rapidamente a solução de descolamento de células das células (garantindo que as colônias de células ainda estejam presas à placa, embora frouxamente). Enxágue suavemente as células uma vez com DMEM/F12 para remover a solução de descolamento celular.
3. Adicione 3 mL de hiPS CCM às células hiPS (em cada poço de uma placa de 6 poços) que foram tratadas com a solução de descolamento celular. Raspe as colônias usando um elevador de células e pipete suavemente a suspensão de células para cima e para baixo para desalojar as células frouxamente aderidas. Lave bem a placa para garantir que todas as células sejam colhidas.
   nota: Recomenda-se o uso de uma pipeta de 5 mL para evitar cisalhamento excessivo nas células.
4. Transfira 0,5 mL da suspensão celular para cada poço de uma nova placa de 6 poços revestida com 1 matriz BM contendo 2 mL de hiPS CCM por poço. Deslocar a placa em forma de oito para distribuir as colónias celulares nos alvéolos e incubar a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5 %. Atualizar o meio diariamente até que as células estejam prontas para serem passadas ou utilizadas para a experiência de diferenciação (aproximadamente 70 % de confluência).
   nota: O tamanho ideal da colônia para a passagem de rotina de iPSCs é entre 200-500 μm em condições livres de alimentador usando hiPS CCM (sem inibidor de ROCK). Se as células forem individualizadas durante o tratamento com enzimas de dissociação ou tampões, o hiPS CCM pode ser suplementado com inibidor de ROCK (por exemplo, 10 μM Y27632) para melhorar a viabilidade celular.

4. Diferenciação de células hiPS em células do mesoderma (dias 0–2)

1. Enquanto as culturas de células hiPS estão na fase de crescimento exponencial (aproximadamente dentro de 4 dias após a cultura após a passagem e cerca de 70% de confluência), inspecione visualmente a presença de células espontaneamente diferenciadas dentro e ao redor das bordas das colônias. Se necessário, raspe assepticamente as áreas de diferenciação.
2. Aspire hiPS CCM das células hiPS e enxágue as células 3 vezes com DMEM/F12 quente. Incubar as células com 1 ml de tampão de dissociação de células sem enzimas durante 10 min a 37 °C e verificar a dissociação ao microscópio. Devido às diferenças inerentes entre as diferentes linhagens celulares hiPS, o tempo real de incubação do tampão de dissociação celular deve ser determinado para uma determinada linhagem celular.
3. Raspe suavemente o poço com um elevador de células para desalojar as células frouxamente aderidas e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, seguido de pipetagem para cima e para baixo várias vezes para individualizar as células hiPS.
   1. Leve a suspensão celular ao volume de 15 mL com DMEM/F12 quente e centrifugue por 5 min a 290 x g à temperatura ambiente.
   2. Aspire suavemente o sobrenadante e ressuspenda as células com DMEM/F12 quente para outra rodada de centrifugação para remover a matriz residual de BM 1 e os componentes do tampão de dissociação.
4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio de indução do mesoderma, conforme descrito acima. Conte o número total de células usando um hemocitômetro ou contador de relha para determinar o volume apropriado de meio de diferenciação do mesoderma necessário para atingir uma concentração de 1 x 10⁵ células / mL.
5. Aspire a solução de ECM das placas revestidas com matriz BM 2 e enxágue as placas duas vezes com DMEM/F12 quente. Misture a suspensão de células hiPS suavemente pipetando algumas vezes. Transfira 1 mL da suspensão celular para cada poço das placas de 12 poços revestidas com matriz BM 2 e, em seguida, agite suavemente as placas para distribuir as células de maneira mais uniforme.
6. Incubar a placa a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%. Atualize o meio de indução do mesoderma no dia seguinte.
   nota: Após 2 dias, as células do mesoderma derivadas de células hiPS estariam prontas para a indução intermediária do mesoderma.

5. Diferenciação de células do mesoderma derivadas de células hiPS em mesoderma intermediário (dias 2–16)

1. No dia 2 do protocolo de diferenciação, aspire o meio de indução do mesoderma e reabasteça com 1 mL por meio de indução do mesoderma intermediário do poço.
2. Atualize o meio todos os dias para manter um limite preciso de fatores de crescimento e pequenas moléculas para as células metabolicamente ativas. Se houver crescimento celular substancial e rápida depleção dos nutrientes do meio (indicado pelo amarelecimento do meio), o volume do meio intermediário de diferenciação do mesoderma pode ser aumentado para 1,3 mL por poço das placas de 12 poços.
3. Cultive células por mais 14 dias para obter células intermediárias do mesoderma. No dia 16, essas células podem ser criopreservadas para uso posterior.

6. Diferenciação de células intermediárias do mesoderma derivadas de células hiPS em podócitos (dias 16–21)

1. Enxágue as células intermediárias do mesoderma com DMEM/F12 quente, seguido de incubação das células com 0,5 mL por poço de tripsina-EDTA a 0,05% por 3 min a 37 °C. Realize uma inspeção visual para garantir que as células estejam começando a se dissociar.
2. Raspe as células usando um elevador de células e pipete a suspensão celular várias vezes usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL para obter células individualizadas (ou pequenos aglomerados de).
   nota: Nesta fase, certifique-se de que as células estejam totalmente dissociadas, pois as células agregadas podem não conseguir adquirir um fenótipo diferenciado terminalmente dentro da linha do tempo do protocolo.
3. Adicione cerca de 2 mL por poço de solução neutralizante de tripsina para interromper a atividade da tripsina.
4. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL e aumente o volume para 50 mL usando DMEM / F12 e, em seguida, centrifugue a suspensão da célula por 5 min a 201 x g à temperatura ambiente.
5. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no meio de indução de podócitos. Para obter os melhores resultados, garanta uma densidade de semeadura final de aproximadamente 100.000 células/poço de uma placa de 12 poços. Adicione a suspensão celular às placas revestidas com matriz BM 2 e agite suavemente a placa para ajudar a distribuir as células de maneira mais uniforme.
6. Incubar células a 37 °C e 5% de CO₂ e atualizar o meio diariamente por até 5 dias para obter podócitos no dia 21.
   nota: Os podócitos derivados de células hiPS resultantes podem ser mantidos em cultura por 2 a 4 semanas adicionais usando meio completo com meios de manutenção de podócitos. Uma vez em meios de manutenção de podócitos, as células podem ser alimentadas em dias alternados e podem ser usadas para estudos subsequentes ou análises a jusante.