Isolamento de células musculares lisas detrusoras: um procedimento de digestão enzimática para obter células DSM de amostras de bexiga urinária humana

Resumo

Fonte: Malysz, J. et al. Preparação e Utilização de Células Musculares Lisas Detrusor Humanas Recém-Isoladas para Caracterização de Correntes Catiônicas Sensíveis ao 9-Fenantrol. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células musculares lisas detrusoras de amostras de bexiga urinária humana usando um tratamento enzimático sequencial em duas etapas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Dissecção de tecidos DSM e preparação de peças DSM sem mucosa

1. Examine a amostra de bexiga urinária de espessura total que chegou ao laboratório da sala de cirurgia em um recipiente hermeticamente fechado cheio com a solução de dissecação/digestão a frio (Figura 1 e Tabela 1 para composição de DS).
   nota: A amostra geralmente é mantida em DS frio de algumas horas a uma noite antes da chegada ao laboratório. Para armazenamento mais longo, o DS (Tabela 1) é complementado com 1 mM de CaCl₂.
2. Remova e enxágue a amostra DSM de espessura total humana (contendo todas as camadas, incluindo mucosa, DSM e serosa) com DS gelada para lavar os detritos e o sangue presos.
3. Prenda a amostra da bexiga urinária, com a mucosa voltada para cima e a serosa para baixo, em um prato redondo de 150 mm de diâmetro revestido com enantiômero de silicone (Tabela de Materiais) preenchido com DS gelado (Figura 1B).
4. Remova o tecido adiposo adjacente, vasos sanguíneos, epitélio (urotélio) e mucosa muscular da amostra por dissecção afiada usando microtesoura e fórceps.
5. Corte várias peças DSM sem mucosa (~ 2–3 mm de comprimento e 4–6 mm de largura) (Figura 1C).

2. Dissociação enzimática de peças de DSM produzindo células DSM únicas recém-isoladas

1. Coloque 3 a 6 peças de DSM em um tubo contendo 1 a 2 mL de DS pré-aquecido (~ 37 ° C) contendo papaína e ditiotreitol (DS-P, Tabela 1) e incube peças de DSM em DS-P por 30 a 45 min a ~ 37 ° C, agitando suavemente o tubo ocasionalmente (uma vez a cada 10 a 15 min).
   nota: Para controlar de forma ideal a temperatura para tratamento enzimático, tubos com pedaços de tecido e soluções enzimáticas são colocados em uma câmara de tecido de vidro cheia de água conectada a um banho-maria aquecido circulante (Figura 1D) ou em um banho-maria com agitação de alta precisão com temperatura controlada (Figura 1E).
2. Remova o DS-P do tubo, lave brevemente as peças do DSM com DS gelado, descarte o DS frio do tubo deixando as peças do DSM no fundo do tubo.
3. Adicione 1 a 2 mL de colagenase tipo II (DS-C, Tabela 1) contendo DS ao tubo com pedaços de DSM; misture e incube suavemente por 25 a 40 min a ~ 37 ° C, agitando suavemente o tubo ocasionalmente (a cada 10 a 15 min).
4. Descarte o DS-C e lave os pedaços de DSM tratados com enzimas 5 a 10 vezes com DS gelado.
5. Após a última lavagem, deixe a solução de DS dentro do tubo; triture suavemente com uma pipeta Pasteur polida várias vezes para liberar células DSM individuais.
6. Coloque algumas gotas de solução DS contendo células DSM dispersas em uma câmara com fundo de vidro ou uma lamínula e inspecione visualmente a qualidade sob um microscópio (usando uma objetiva de 20x ou 40x) após pelo menos 5 minutos após a aplicação para permitir que as células adiram ao fundo.
7. Use imediatamente células DSM recém-isoladas para experimentos eletrofisiológicos ou armazene as células em um tubo contendo DS a ~ 4 ° C no gelo ou na geladeira até o uso (normalmente por até 8 h de preparação).
   nota: Dentro da mesma preparação, a qualidade das células varia de células DSM mortas altamente viáveis a superdigeridas (Figura 2). Quando o método sequencial de papaína-colagenase produz um número muito alto de células inviáveis, a preparação é descartada e uma nova digestão de pedaços de DSM é realizada, mas com intervalos de incubação reduzidos. Se o procedimento resultar em poucas células DSM, para a digestão subsequente das peças DSM, os intervalos de incubação são aumentados. A imunorreatividade positiva à actina do músculo liso α confirma a identidade das células do DSM (Figura 3).

Tipo de solução	Composição (em mM)
DS (Solução de Dissecção / Digestão)	80 Na-glutamato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 e 11 glicose, pH ajustado para 7,4 (com 10 M NaOH)
DS-P (DS contendo papaína)	DS contendo 1-2 mg/ml de papaína, 1 mg/ml de ditiotreitol e 1 mg/ml de albumina de soro bovino
DS-C (DS contendo colagenase)	Solução DS contendo 1-2 mg/ml de colagenase tipo II, 1 mg/ml de albumina sérica bovina, 0 ou 1 mg/ml de inibidor de tripsina e 100-200 μM de Ca2+
P (pipeta)	110 CsOH, 110 ácido aspártico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA e 30 CsCl, pH ajustado para 7,2 com CsOH e suplementado com anfotericina B (300-500 μg/ml)
E (Extracelular)	10 cloreto de tetraetilamônio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES e 10 glicose, pH ajustado para 7,3-7,4 com NaOH ou CsOH e 0,002-3 (2-3 mM) de nifedipina

Tabela 1: Composições de solução de dissecação/digestão (DS) e pipeta e soluções extracelulares usadas em experimentos de patch-clamp perfurado.

Resultados

Figura 1: Resumo das etapas de dissecção que resultaram na preparação das peças do músculo liso detrusor (DSM) e configuração usada para dissociação enzimática. São mostradas imagens de: (A) uma amostra de bexiga urinária humana de espessura total fornecida por uma cirurgia de bexiga aberta como material cirúrgico estranho em SD gelado, (B) a mesma p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml	falcão	352054	Tubos para DS contendo enzimas usadas nas etapas de digestão
Misturador de vórtice analógico	VWR	Rolamento 58816-121
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A7906	Ds
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016	Solução extracelular e SD
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Quelante de Ca2+, usado em solução de pipeta intracelular
glicose	sigma	G8270
Colagenase tipo 2	Corporação Bioquímica Worthington	LS004177	DS-C
Hidrato de hidróxido de césio	Sigma-Aldrich	C8518	Solução de pipeta intracelular
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluções extracelulares e intracelulares
DL-Ditiotreitol (DDT)	Sigma-Aldrich	D9779	Agentes redutores usados em conjunto com a papaína
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloqueador de canal de Ca2+ dependente de voltagem tipo L
Rack/suporte de tubo de espuma flutuante	VWR Scientific	Rolamento 82017-634	Usado para segurar tubos com enzimas para controle de temperatura
Ácido glutâmico (sal Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
papaína	Corporação Bioquímica Worthington	LS003126	DS-P
MgCl2 (hexahidratado)	Sigma-Aldrich	M2670	Soluções extracelulares e intracelulares
Kcl	Fisher Científico	BP366-1	Solução extracelular
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluções extracelulares e intracelulares
Agulha de seringa não metálica, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Enchimento da solução de pipeta intracelular
Pipeta Pasteur	Marca Fisher	13-678-20A	As pontas são quebradas e polidas a fogo e usadas para titulação de tecidos tratados enzimaticamente para liberar células DSM únicas de pedaços
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampão de pH
Banho-maria agitado Thermo Scientific Precision (modelo 2870)	Thermo Científico	Descontinuado	Banho-maria para controle de temperatura da digestão enzimática empregado como alternativa à configuração do banho de circulação em câmara de tecido
Tubos de vinil	ColePalmer	06405-3	Múltiplos usos, incluindo para conectar o banho de tecido ao banho-maria circulante
Banho de circulação de água, Haake D1 L	Haake	Descontinuado	Conectado ao banho de tecido
Microscópio invertido ZeissAxiovert 40C com objetivas de 10x e 40x	Carl-Zeiss	Descontinuado	Parte da configuração do equipamento de fixação de remendo