Análise de Patch-Clamp Perfurado Mediada por Anfotericina B: Uma Técnica Eletrofisiológica para Estudar Correntes Iônicas em Células da Bexiga Urinária

Abstract

Fonte: Malysz, J. et al. Preparação e Utilização de Células Musculares Lisas Detrusor Humanas Recém-Isoladas para Caracterização de Correntes Catiônicas Sensíveis ao 9-Fenantrol. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a caracterização das correntes catiônicas dos canais iônicos de melastatina tipo 4 (TRPM4) com potencial receptor transitório em células musculares lisas detrusoras usando a técnica de patch-clamp perfurado mediado por anfotericina B. A técnica ajuda a avaliar as propriedades biofísicas e farmacológicas dos canais iônicos.

Protocol

1. Registro de correntes catiônicas induzidas por passo de tensão de células DSM usando a técnica de patch-clamp de tensão de célula inteira perfurada com anfotericina B

1. Pipete 0,25–1 mL de suspensão celular em uma câmara com fundo de vidro em um estágio de microscópio invertido e permita que as células adiram ao fundo de vidro.
2. Após incubação por pelo menos 45 min, remova a solução de digestão (DS) do banho e substitua pela solução E (Tabela 1) por superfusão, onde o fluxo de solução auxiliada por gravidade através da tubulação de entrada substitui lentamente a DS pela nova solução, enquanto a tubulação de saída conectada a um recipiente de resíduos a vácuo remove a solução da câmara e evita o transbordamento.
   nota: A solução E contém íons tetraetilamônio (TEA⁺) e césio (Cs⁺) para inibir as correntes de K⁺.
3. Preparar uma solução de trabalho de anfotericina B em dimetilsulfóxido (DMSO) (1 mg por 10 μL de DMSO). Para dissolver completamente o pó de anfotericina, sonice (pelo menos 15 min) e vortex a solução bem.
   nota: Esta etapa geralmente leva menos de 10 minutos. A dissolução de 3 a 4 mg de anfotericina B em 30 a 40 μL de DSMO em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL funciona bem. Quantidades maiores de anfotericina B requerem mais solvente DSMO, normalmente resultando em um intervalo mais longo para mistura e solubilização incompleta das partículas sólidas de anfotericina B presentes no tubo.
4. Dissolva a solução estoque de anfotericina B na solução de pipeta (solução P, Tabela 1) para obter uma concentração final de 200–500 μg / mL. Esta etapa requer sonicação e vórtice extensivos em uma configuração de alta velocidade (8–10/10) por ~30 a 60 min por etapa para garantir a mistura ideal e a prevenção da formação de precipitado de anfotericina B na solução de pipeta.
   nota: A anfotericina B precipitará com o tempo e é sensível à luz. A solução de pipeta de trabalho contendo anfotericina B é verificada quanto à solubilidade, misturada manualmente antes do enchimento da pipeta e mantida no escuro.
5. Puxe vários eletrodos de remendo, pontas de eletrodos de polimento de fogo e (se necessário) cubra as pontas com cera dental.
6. Encha a ponta de um eletrodo de remendo com a solução de pipeta (solução P, Tabela 1) sem anfotericina B, mergulhando brevemente o eletrodo na solução.
7. Preencha o eletrodo com a mesma solução de pipeta contendo anfotericina B.
8. Monte o eletrodo em um suporte conectado a um patch-clamp amplifier headstage.
9. Usando um micromanipulador, coloque o eletrodo logo abaixo da superfície da solução extracelular de modo que a ponta do eletrodo fique submersa.
10. No modo de grampo de tensão, defina o potencial de retenção para 0 mV e ajuste a corrente para 0 pA com o dial de deslocamento da pipeta no amplificador comercial (Tabela de Materiais).
11. Determine a resistência do eletrodo usando a janela/função Teste de Membrana do software de aquisição comercial (Tabela de Materiais). Para ativar, clique em Ferramentas>Teste de membrana>Reproduzir ou em um ícone de atalho no software. A resistência do eletrodo determinada deve estar na faixa de 2 a 5 MΩ.
    nota: A função de teste de membrana fornecida no software de aquisição comercial ou na opção de teste de vedação no amplificador pode ser usada para monitorar a resistência do eletrodo aplicando etapas de tensão repetidamente.
12. Continue monitorando a resistência do eletrodo enquanto avança o eletrodo em direção a uma célula DSM escolhida com um micromanipulador (Figura 1A).
    nota: Para ser considerada uma célula DSM viável, a célula deve mostrar morfologia alongada em forma de fuso, um halo bem definido ao redor da célula, bordas nítidas e aparência semicontrátil (serpentina).
13. Ao tocar a superfície da célula com o eletrodo - indicado por um rápido aumento na resistência do eletrodo medida com a função de teste de membrana - forme uma giga-vedação aplicando pressão negativa rápida e suave ao suporte do eletrodo por meio de tubulação. Isso resulta em pressão negativa criada na ponta do eletrodo que puxa a membrana celular para dentro do eletrodo, auxiliando na formação de um giga-selo ou um contato muito estreito entre o eletrodo e a membrana plasmática (Figura 1B).
14. Assim que o giga-selo se formar, compense a capacitância da pipeta ajustando os mostradores rápidos e lentos no amplificador comercial e monitore a estabilidade do giga-selo (corrente de fuga) usando a função de teste de membrana.
15. Aguarde um tempo, normalmente de 30 a 60 minutos, para que a anfotericina B se difunda pela pipeta e seja inserida na membrana plasmática, formando poros principalmente seletivos aos cátions monovalentes. Durante esta etapa, continue monitorando o giga-selo com a função Teste de Membrana. À medida que a perfuração celular aumenta, também aumenta a amplitude dos transientes de capacitância (compare a Figura 1B com a Figura 1C exibindo nenhuma e efetiva perfuração celular, respectivamente) medida com a função Teste de Membrana.
16. Quando a perfuração do patch for ideal (julgada pela resistência em série estável normalmente abaixo de 50 MΩ), cancele os transientes de capacitância ajustando os mostradores para capacitância da célula e resistência em série no amplificador. A compensação da resistência em série também pode ser realizada neste momento (Figura 1D).
17. Uma vez observadas correntes catiônicas induzidas por passo de tensão estável evocadas pelo protocolo especificado, aplique um composto ou condição fisiológica para testar por superfusão e registre as respostas para o controle, condição de teste e lavagem (se possível) com o software de aquisição comercial.
    1. Registre as correntes com um protocolo de passo de tensão de rotina que envolve manter as células DSM em -64 ou -74 mV e escalonar a tensão em incrementos de 10 mV por 400 ou 500 ms de -94 a +96 ou +106 mV e retornar ao potencial de retenção.
       nota: Os valores do potencial de membrana são ajustados para um potencial de junção líquida de 14 mV (usando soluções de P e E, Tabela 1). O potencial de junção líquida é obtido no software de aquisição comercial (Tabela de Materiais) clicando em Ferramentas>Potenciais de Junção e inserindo as concentrações dos componentes de íons da solução. Um protocolo de rampa também pode ser usado para obter gravações atuais.
    2. Execute o protocolo de tensão em um intervalo contínuo de ~ 1 min durante um experimento registrando correntes para controle de pré-adição, condição de teste e lavagem

Tipo de solução	Composição (em mM)
DS (Solução de Dissecção / Digestão)	80 Na-glutamato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 e 11 glicose, pH ajustado para 7,4 (com 10 M NaOH)
DS-P (DS contendo papaína)	DS contendo 1–2 mg/ml de papaína, 1 mg/ml de ditiotreitol e 1 mg/ml de albumina de soro bovino
DS-C (DS contendo colagenase)	Solução DS contendo 1–2 mg/ml de colagenase tipo II, 1 mg/ml de albumina de soro bovino, 0 ou 1 mg/ml de inibidor de tripsina e 100-200 μM de Ca2+
P (pipeta)	110 CsOH, 110 ácido aspártico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA e 30 CsCl, pH ajustado para 7,2 com CsOH e suplementado com anfotericina B (300-500 μg/ml)
E (Extracelular)	10 cloreto de tetraetilamônio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES e 10 glicose, pH ajustado para 7,3–7,4 com NaOH ou CsOH e 0,002–3 (2–3 mM) de nifedipina

Tabela 1: Composições de solução de dissecação/digestão (DS) e pipeta e soluções extracelulares usadas em experimentos de patch-clamp perfurado.

Results

Figura 1: Ilustração esquemática das etapas envolvidas na formação de giga-selos e perfuração de anfotericina B de células DSM humanas. Ilustradas são as posições espaciais de uma pipeta contendo anfotericina B e uma célula DSM, juntamente com as respostas associadas para testes de membrana obtidos no software de aquisição comercial (Tabela de Materiais) alterando os...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml	falcão	352054	Tubos para DS contendo enzimas usadas nas etapas de digestão
Anfotericina B	pescador	BP928-250	Usado para perfuração de patch / célula
Anfotericina B	Padrões de referência da Farmacopeia Europeia	5	Usado para perfuração de patch / célula
Anfotericina B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Usado para perfuração de patch / célula
Misturador de vórtice analógico	VWR	Rolamento 58816-121
ácido aspártico	Sigma-Aldrich	A9006	Solução de pipeta intracelular
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	Solução extracelular e SD
Vidro capilar	Sutter	BF150-110-7.5	Capilar para preparação de eletrodos de patch puxados
Hidrato de hidróxido de césio	Sigma-Aldrich	C8518	Solução de pipeta intracelular
O software Clampex ver. 10 inclui programas de aquisição de dados (Clampex) e análise (Clampfit)	Instrumentos de axônio / dispositivos moleculares	pCLAMP-10	Software comercial e parte da configuração do equipamento de fixação de remendo
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluções extracelulares e intracelulares
Cera dental	Miltex Dental Wax Technologies, Inc.	18058351
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	solvente
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Quelante de Ca2+, usado em solução de pipeta intracelular
Extrator de micropipeta flamejante/marrom	Sutter	Pág. 97	Necessário para puxar eletrodos com pontas muito finas
Rack/suporte de tubo de espuma flutuante	VWR Scientific	Rolamento 82017-634	Usado para segurar tubos com enzimas para controle de temperatura
glicose	sigma	G8270
Ácido glutâmico (sal Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampão de pH
Kcl	Fisher Científico	BP366-1	Solução extracelular
Sistema de aquisição de dados de baixo ruído	Instrumentos de axônio / dispositivos moleculares	Digidata 1440A	Parte da configuração do equipamento de fixação de remendo
Agitador magnético	VWR	01-442-684
MgCl2 (hexahidratado)	Sigma-Aldrich	M2670	Soluções extracelulares e intracelulares
MicroForge	Narishige	MF-830	Usado para eletrodos de polimento de fogo
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluções extracelulares e intracelulares
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloqueador de canal de Ca2+ dependente de voltagem tipo L
Microscópio invertido Nikon, TS100 com platina T1-SM com objetivas de 5x, 10x, 20x e 40x	Nikon	Descontinuado	Parte da configuração do equipamento Patch-clamp
Agulha de seringa não metálica, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Enchimento da solução de pipeta intracelular
Pipeta Pasteur	Marca Fisher	13-678-20A	As pontas são quebradas e polidas a fogo e usadas para titulação de tecidos tratados enzimaticamente para liberar células DSM únicas de pedaços
Amplificador de fixação de remendo	Instrumentos de axônio / dispositivos moleculares	Axônio Axopatch 200B	Parte da configuração do equipamento de fixação de remendo
Computador PC	vale	Configuração personalizada	Parte da configuração do equipamento de fixação de remendo
Medidor de pH	Instrumentos Aspera	PH700
Tubulação de polietileno	Intramédico	427-436	Tubos para superfusão de banho extracelular conectados à câmara de gravação com fundo de vidro
Cloreto de tetraetilamónio	Sigma-Aldrich	T2265	Bloqueador de canais iônicos dos canais Kv e BK adicionado à solução de banho extracelular
Balança de ponderação	Mettler Toledo	XS64
Microscópio invertido ZeissAxiovert 40C com objetivas de 10x e 40x	Carl-Zeiss	Descontinuado	Parte da configuração do equipamento de fixação de remendo