Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
NOTA: Camundongos selvagens saudáveis (WT) não tratados (n = 4) e camundongos cd44-/- (n = 4) foram sacrificados com a idade de 12 a 16 semanas. Foram utilizados camundongos machos e fêmeas. Todos os camundongos estavam no fundo C57Bl / 6.
1. Dissecção do rim de camundongo
- Sacrifique camundongos WT saudáveis ou camundongos geneticamente alterados por luxação cervical.
- Disseque os rins inteiros do camundongo diretamente após sacrificar os camundongos. Para isso, faça uma laparotomia mediana com tesoura abdominal, cortando a pele e depois os músculos abdominais. Retire o intestino e coloque-o ao lado do rato.
- Libere os rins do tecido de conexão e retire o rim usando uma pinça cirúrgica, cortando a artéria renal, a veia renal e o ureter com uma tesoura.
- Remova as cápsulas renais dos rins segurando o rim com uma pinça cirúrgica e retire a cápsula usando outro par de pinças.
- Coloque os rins em uma placa de cultura de células de 6 poços (2 rins/poço) preparada com 2 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) por poço e coloque no gelo.
2. Isolamento de glomérulos do rim de camundongo
- Transfira os rins para uma placa de Petri de 100 mm e pique os rins em pequenos pedaços de 1−2 mm usando dois bisturis. Mantenha os pedaços de rim picados úmidos usando 1−2 mL de HBSS.
- Coloque os pedaços de rim picados em cima de uma peneira de metal de 300 μm e pressione o rim através da peneira usando um êmbolo de uma seringa de 20 mL. Enxágue repetidamente a peneira com HBSS no meio e colete o fluxo em uma placa de Petri limpa usando uma pipeta sorológica. Recolha também tudo o que resta/gruda no fundo da peneira, raspando-o com o bisturi e transferindo-o para o fluxo coletado (homogeneizado renal).
- Lavar o homogeneizado renal através de um peneiro de 75 μm com HBSS. Recolher o escoamento e, em seguida, enxaguar este escoamento através de um peneiro de 53 μm. Lave as duas peneiras usando HBSS para remover todas as estruturas menores.
nota: Nesta etapa, o fluxo é apenas enxaguado, mas não pressionado, através da peneira de 75 μm e 53 μm. A lavagem com HBSS é necessária para remover detritos e estruturas menores nas peneiras. Portanto, normalmente 200−300 mL de HBSS são usados no total.
- Colete as estruturas/materiais renais que permanecem na peneira de 75 μm e 53 μm lavando a superfície superior das peneiras com meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 20% de soro fetal de bezerro (FCS) e transfira o material para uma microplaca de fixação ultrabaixa de 6 poços.
nota: Para lavar a superfície superior da peneira, lave-a em uma posição inclinada (>45°) e recolha o material renal na borda da peneira. O material coletado é enriquecido para glomérulos encapsulados e descapsulados, apresentando apenas alguns fragmentos tubulares. Os glomérulos encapsulados são muito pegajosos. Para coletar glomérulos únicos, é importante evitar que os glomérulos adiram à superfície de uma placa de Petri ou placa de poço. Para evitar aderência, use meio com 20% de FCS e use placas de fixação ultrabaixas para esta etapa.
3. Cultura de crescimento glomerular
- Traga a microplaca de fixação ultrabaixa para um microscópio de luz invertida e colete glomérulos encapsulados e/ou descapsulados individuais com uma pipeta de 20 μL. Evite pipetar outras estruturas e detritos. Depois de coletar um único glomérulo na ponta da pipeta, adicione meio DMEM fresco sem material renal coletado na mesma ponta da pipeta a um volume de 20 μL.
- Transfira o glomérulo único com o meio DMEM de 20 μL para o centro de um poço de uma placa de cultura de células de 24 poços e incube por 3 h a 37 ° C e 5% (v / v) de CO2 para permitir a fixação do glomérulo ao centro do poço. Mova cuidadosamente a placa para evitar a flutuação do glomérulo para as bordas do poço.
- Após 3 h de incubação, o glomérulo é fixado ao centro do poço. Adicione cuidadosamente 500 μL de meio basal endotelial (EBM) suplementado com um kit de fator de crescimento contendo hidrocortisona, fator de crescimento endotelial humano, extrato de cérebro bovino e sulfato de gentamicina-anfotericina B (Tabela de Materiais) e 5% (v / v) FBS e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (caneta / estreptococo) para cada poço.
- Cultivar os glomérulos individuais por 6 dias a 37 °C, 5% (v/v) CO2,
NOTA: Dentro de 6 dias, o crescimento consistindo de células epiteliais parietais é formado. Se alguém pretende testar os efeitos de compostos ou drogas específicas nas células epiteliais parietais, deve ser adicionado ao meio dentro deste período de 6 dias.
