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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Implantando o tumor
NOTA: Cada camundongo é implantado com 1 x 10células 5 MB49-PSA em 50 μL de meio em branco DMEM na bexiga. Devido ao espaço morto no cateter, sempre prepare um volume extra (pelo menos 100 μL extras por mouse). Uma abordagem alternativa seria usar uma seringa cheia de ar.
- Células
- Um dia antes do implante, quando as células são aproximadamente 80% confluentes, passe as células tumorais MB49-PSA em meio DMEM completo (suplementado com 10% de FBS, 2 mmol / L de L-glutamina, 0,05 mg / mL de penicilina-estreptomicina e 200 μg / mL de higromicina B) a 37 ° C e 5% de CO2 em uma proporção de divisão de 1: 2.
- No dia do procedimento, colha as células raspando-as suavemente com um raspador de células estéreis. Misture volumes iguais da suspensão celular e uma solução de azul de tripano a 0,4%. Conte as células vivas usando um hemocitômetro. Não implante se mais de 20% das células estiverem mortas.
- Calcule o número de células vivas necessárias (2 x 106 células/mL) e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet da célula em meio em branco DMEM. Repita a lavagem três vezes para remover todos os vestígios de FBS antes da implantação.
- Mantenha a suspensão celular no gelo até que os camundongos estejam prontos para a implantação.
- Permita que os camundongos C57BL / 6J fêmeas de 4 a 6 semanas de idade se aclimatem por uma semana antes do procedimento. Todo o trabalho com animais deve ser realizado em uma cabine de segurança biológica para manter as condições estéreis.
- Pese cada camundongo e injete anestesia (75 mg / kg de cetamina e 1 mg / kg de medetomidina) por via intraperitoneal a 0,1 mL por 10 g de peso corporal. Os pesos corporais devem estar entre 17 e 22 g. Confirme a anestesia observando nenhuma resposta após um beliscão do dedo do pé.
- Para identificação, marque a orelha usando um punção de orelha.
- Injete a solução de Hartmann ou lactato de sódio composto por via intraperitoneal a 0,1 mL por 10 g de peso corporal a cada 1–2 h para hidratação.
- Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos usando um bulbo de algodão estéril, pois o reflexo de piscar é perdido sob anestesia e os olhos secam. Reaplique quando necessário.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal em toalhas de papel em cima de uma bolsa de calor (ativada pelo contato com o ar) para manter a temperatura corporal e prender as patas traseiras.
- Com um dedo, aplique uma leve pressão na região abdominal inferior e colete a urina da bexiga em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta amostra serve como o valor basal do PSA urinário.
- Retire a poli-L-lisina estéril (PLL) para uma seringa de 1 mL e conecte um cateter IV de calibre 24, com o estilete de agulha removido. Aplique lubrificante na ponta do cateter e insira o cateter através da uretra na bexiga usando uma pinça para guiar o cateterismo. Pare quando a resistência for sentida.
NOTA: Os pesquisadores devem discutir com sua equipe veterinária sobre a necessidade do uso de um gel lubrificante com anestésico para instilações intravesicais e o uso de analgésicos pós-procedimento.
- Instilar 50 μL de PLL lentamente, a uma taxa de 10 μL a cada 20 s, para evitar o refluxo vesicoureteral. Deixe o cateter na bexiga por 20 minutos com uma rolha para evitar o fluxo de saída.
- Após 20 minutos, remova o cateter e retire a bexiga de qualquer conteúdo pressionando suavemente a região abdominal inferior. Usando uma seringa vazia de 1 mL, lave qualquer conteúdo restante para fora do cateter.
- Misture bem as células MB49-PSA pipetando e retire-as para uma seringa de 1 mL. Conecte o cateter e aplique lubrificante. Instilar 50 μL de 1 x 105 células a uma taxa lenta de 10 μL a cada 20 s. Recoloque a rolha no cateter. Dê aos camundongos controle 50 μL de solução salina.
- Após 1 h, remova os cateteres e esvazie a bexiga de qualquer conteúdo. Remova a fita nas patas traseiras e coloque os ratos em seus lados ventrais. Reviva os camundongos injetando subcutaneamente a droga de reversão (1 mg / kg de atipamezol) a 0,1 mL por 10 g de peso corporal.
- Monitore os camundongos até que a motilidade seja observada. Devolva os ratos para suas gaiolas.