Entrega de plasmídeos de DNA no urotélio da bexiga de camundongo: um procedimento baseado em eletroporação para entregar plasmídeos de DNA de forma eficiente em células uroteliais da bexiga murina para gerar modelos geneticamente modificados

Resumo

Fonte: Chuan, Y. et al. Novo método de entrega de DNA de plasmídeo ao urotélio da bexiga de camundongo por eletroporação. J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo demonstra a entrega de plasmídeo de DNA no urotélio da bexiga do camundongo usando uma combinação de técnicas de cateterismo uretral e eletroporação. O procedimento descrito permite a geração de modelos de câncer de bexiga de camundongos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de plasmídeos e ferramentas

1. Para cada bexiga a ser transfecto, prepare pelo menos 20 μL de plasmídeo de DNA (1 μg/μL).
2. Adicione 1 μL de azul de tripano aos 20 μL de solução de plasmídeo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipete para misturar bem.
3. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilize o espaço de trabalho com etanol 70%. Pulverize instrumentos cirúrgicos e luvas com etanol a 70% com frequência ou use um esterilizador de esferas de vidro ao executar as etapas a seguir para manter as condições estéreis.

2. Entrega de plasmídeo

1. Aplique etanol a 70% no abdômen do camundongo anestesiado e use um bisturi para fazer uma incisão vertical de 1 cm para abrir a pele abdominal acima da bexiga.
2. Pipetar pelo menos 20 μL de plasmídeo mais solução de azul de tripano na extremidade externa do cateter e encaixar a seringa.
3. Injete a solução de plasmídeo na bexiga. Se a bexiga ficar azul, a injeção é bem-sucedida. Deixe um pouco de líquido no cateter para evitar a criação de bolhas de ar na bexiga.
4. Pegue o orifício uretral externo usando uma pinça e, em seguida, remova o cateter e a seringa. Use um barbante para apertar o orifício uretral externo. Faça duas laçadas com o barbante e depois amarre com dois nós.
   nota: O aperto da uretra é importante para evitar o refluxo do líquido do plasmídeo.
5. Ligue o gerador de eletroporação com os seguintes parâmetros: 33V, tempo de trabalho de 50 ms e intervalo de 950 ms.
6. Segure a bexiga com uma pinça e aperte a bexiga com dois eletrodos. Empurre o pedal para realizar a eletroporação.
   nota: Os pulsos elétricos são configurados para ocorrer 5 vezes com intervalos curtos após cada pressão do pedal. O mouse pode se contorcer neste processo. Pressionar o pedal mais de uma vez pode aumentar a eficiência da entrega, mas muitos pulsos elétricos podem danificar a integridade do tecido do urotélio.
   1. Evite qualquer contato entre a pinça e os eletrodos, pois isso gerará uma faísca.

3. Recuperação

1. Suturar a abertura abdominal e cutânea com suturas cirúrgicas estéreis e clipes. Aplique iodo na ferida.
2. Remova o animal do sistema isoflurano. Administre analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica.
3. Mantenha o animal na almofada de aquecimento e devolva-o à gaiola de casa após a recuperação total. Verifique o animal pelo menos uma vez ao dia quanto à mobilidade normal, comportamentos de bebida e alimentação e nenhum sinal de infecção até que a incisão esteja cicatrizada e, em seguida, remova os clipes. Administre injeções subsequentes de analgésico buprenorfina se o animal apresentar sintomas de dor, como redução da higiene, aumento da agressividade e vocalização.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa BD 1mL TB	pescador	148232E
Buprenorfina	sigma	B9275-50MG
Pinças Dumont	Roboz Instr Cirúrgico	RS-5005	Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico
ECM830 SQ Wave Electroporator	Aparelho de Harvard	450052
Cateteres Safelet I.V. Descartáveis Exel International	Fisher Científico	Telefone: 14-841-21	24G, 2,11 cm de comprimento, 0,045 cm de diâmetro externo
Tesoura de micro dissecação extra fina	Roboz Instr Cirúrgico	RS-5135	Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico
Isoflurano	Veterinário um	501017
Tapete de Descanso Aquecido K&H para Pequenos Animais, 9 por 12 Polegadas	amazona		Cubra o tapete térmico com toalhas de papel
Pomada oftálmica	pescador	NC0849514
PBS, pH 7,4	Tecnologias da Vida	10010049
Ponteiras de pipeta 200 μL	EUA Científico	1111-0206
Pontas de pipeta, encaixe universal; 0,1 a 10 μL	pescador	02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmídeo CAG-GFP	Addgene	Rolamento 16664
Pinça de platina 5 mm	Aparelho de Harvard	450489	5 mm de diâmetro
tesoura	Roboz Instr Cirúrgico	RS-5880	Trate com etanol a 70% antes do uso cirúrgico
Cordão de corda	amazona		Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm costura de couro costura corda de linha encerada plana
Fita, Scotch	pescador	19047257
Lubrificante veterinário Therio-gel	Saúde animal PBS	353-736
Mancha azul de tripano	Tecnologias da Vida	15250061
V-1 Sistema de anestesia de mesa	VetEquip	901806
Sutura violeta Vicryl 18" FS-2 corte 5-0	pescador	NC0578475
Iodo de Povidona Walgreens 10%	Walgreens	953982
Clipe de ferida	pescador	Rolamento 18045
Aplicador de clipe de ferida	pescador	1804