Isolamento de exossomos: uma técnica de ultracentrifugação baseada em densidade usando almofada de sacarose para separar exossomos de meios condicionados de células cultivadas

Resumo

Fonte: Faruqu, F. N. et al. Preparação de exossomos para entrega de siRNA às células cancerígenas.J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve uma técnica de ultracentrifugação baseada em densidade para isolar exossomos de meios condicionados colhidos de culturas de células renais embrionárias humanas usando uma almofada de sacarose a 25% (p/p) preparada em óxido de deutério. Os exossomos isolados podem ser usados para aplicações a jusante.

Protocolo

1. Isolamento de exossomos em uma almofada de sacarose

1. Pré-limpe o meio condicionado colhido (CM) por centrifugação diferencial e filtração da seguinte forma.
   1. Centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e rejeitar o sedimento. Repetir mais uma vez esta etapa de centrifugação, recuperando o sobrenadante e descartando o pellet.
   2. Centrifugar o sobrenadante do passo 1.1. a 2.000 x g durante 15 min e 4 °C e rejeitar em seguida o sedimento. Filtrar o sobrenadante recuperado uma vez através de filtros de 0,22 μm.
2. Durante a pré-limpeza, prepare a solução de sacarose a 25% (p/p) em óxido de deutério, pesando com precisão 1,9 g (± 0,001 g) de sacarose em um tubo universal e, em seguida, completando com óxido de deutério até que o peso atinja 7,6 g (± 0,001 g).
3. Encha um tubo de ultracentrífuga (consulte a Tabela de Materiais) com 22,5 mL de CM pré-limpo. Aumente o CM para 22,5 mL com PBS filtrado de 0,22 μm se o volume atual for menor que isso.
4. Coloque uma pipeta de vidro (ver Tabela de Materiais) no tubo e, através dela, adicione 3 mL de solução de sacarose para que a solução forme uma camada separada abaixo do CM.
5. Coloque cuidadosamente o tubo contendo a solução de CM/sacarose em camadas no balde de um rotor basculante (consulte a Tabela de Materiais) e prenda o balde no rotor.
6. Coloque o rotor na ultracentrífuga (consulte a Tabela de Materiais) e gire a 100.000 x g por 1,5 h a 4 °C.
7. Colete 2 mL da camada de sacarose e adicione-os a um frasco de ultracentrífuga (consulte a Tabela de Materiais) contendo 20 mL de PBS filtrado para uma etapa de lavagem.
8. Coloque os tubos em um rotor de ângulo fixo (consulte a Tabela de Materiais) e gire a 100.000 x g por 1.5 h a 4 ° C.
9. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta sorológica de 10 mL e ressuspenda o pellet com 400 μL de PBS filtrado. Manter esta reserva de exossomas a 4 °C ou -80 °C para armazenamento a curto e longo prazo, respetivamente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
sacarose	Fisher Científico	S/8600/60	1 kg
Óxido de deutério (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 gramas
1X solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher Científico	10010015	500 ml
Unidade de filtro de seringa Millex-GP 0,22 μm	Millipore	SLGP033RS
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Rotor basculante	Beckman Coulter	SW45 Ti
Rotor de ângulo fixo	Beckman Coulter	Tipo 70 Ti
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	355631	Policarbonato. enchimento máximo 32 ml
Frascos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	355618	Enchimento mínimo 16 ml, enchimento máximo 25 ml
centrifuga	Eppendorf	5810R
Pipetas de vidro	Fisher Científico	1156-6963
25% p/p almofada de sacarose			Adicione 1,9 g (± 0,001 g) de sacarose em um tubo universal e complete com D2O até que o peso atinja 7,6 g (± 0,001 g). Isso faz ~ 6ml da almofada de sacarose de 25% p / p.