Encapsulamento de siRNA em exossomos usando eletroporação: uma técnica baseada em pulso elétrico para carregar siRNA em exossomos

Resumo

Fonte: Faruqu, F. N. et al. Preparação de exossomos para entrega de siRNA às células cancerígenas. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve um método baseado em eletroporação para encapsular siRNA em exossomos. Os exossomos carregados de siRNA podem então ser usados para aplicações terapêuticas.

Protocolo

1. Encapsulamento de siRNA em exossomos por eletroporação

1. Pré-resfrie a cubeta de eletroporação (consulte a Tabela de Materiais) em gelo por 30 minutos antes da eletroporação.
2. Misture 7,0 μg de exossomos (32 μL de estoque de 7 x 10¹² p / mL em PBS) com 0,33 μg de siRNA (12 μL de estoque de 2 μM em água livre de RNase) no tubo de microcentrífuga. Completar o volume até 150 μL com tampão ácido cítrico (ver Tabela de Materiais). A razão molar do exossomo para siRNA é de 1:60 neste caso.
3. Transfira a mistura para a cubeta de eletroporação. Tampe a cubeta e coloque-a no suporte da cubeta do eletroporador (consulte a Tabela de Materiais). Gire a roda giratória 180° no sentido horário.
   nota: A roda deve ser girada completamente para a posição travada, para que a cubeta entre em contato com os eletrodos.
4. Selecione o programa de eletroporação desejado (por exemplo, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) e inicie a eletroporação pressionando o botão Iniciar.
   nota: Um pulso bem-sucedido é indicado mostrando "OK" no visor.
5. Uma vez eletroporada, remova a cubeta depois de girar a roda 180° no sentido anti-horário. Retirar a amostra da cubeta com a pipeta de plástico para posterior processamento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(Rotulado-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (Sem rótuloAS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Pipetas de vidro	Fisher Científico	1156-6963
Amaxa Nucleofector I	Lonza	Nucleofector I	Com os kits Nucleofector da Amola
Tampão de ácido cítrico com EDTA			Misturar 0,1954 g de ácido cítrico e 0,2087 g de fosfato dissódico em 50 ml de água desionizada. Adicione EDTA a 0,1 mM. Ajuste o pH para 4,4.
Tubos de microcentrífugas	Laboratório estelar	S1615-5500	1,5 ml