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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Processamento de Tecidos e Isolamento de Células Tubulares Primárias
- Remova as cápsulas renais e a medula, pique ambos os rins em pedaços minúsculos e incube-os em 10 mL de um tampão de digestão em um forno a 37 ° C com rotação suave por 5 min.
- Remova quaisquer tecidos renais não digeridos passando o tampão por um filtro de 70 μm. Adicione 10 mL de meio de cultura para interromper a digestão.
- Para coletar células tubulares, centrifugue a suspensão de células filtradas a 50 x g por 5 min para coletar o primeiro pellet. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicione 5 mL de meio de cultura, centrifugue-o a 50 x g por 5 min para garantir que todas as células tubulares sejam coletadas no segundo pellet. A centrifugação é a uma velocidade mais baixa para principalmente pellet túbulos pesados. Posteriormente, após as células se recuperarem do isolamento, a cultura tubular pura é centrifugada a uma velocidade mais alta durante as subculturas.
- Ressuspender o primeiro sedimento em 20 ml de meios de cultura e centrifugá-lo a 50 x g durante 5 min para recolher o terceiro sedimento.
- Ressuspenda o segundo e o terceiro pellets em 1 mL de meio de cultura. Misture 10 μL da suspensão celular com 10 μL de Trypan Blue, carregue a mistura na câmara A de uma lâmina de contagem e registre a viabilidade celular do contador automático de células.
- Semeie até 107 células (uma população heterogênea) em um único prato de 60 mm pré-revestido com colágeno e deixe as células tubulares se fixarem durante a noite.