Coloração com ácido periódico de Schiff ou PAS: um método para avaliar as deformidades estruturais do glomérulo

Resumo

Fonte: Stevens, M., Oltean, S. Avaliação da função renal em modelos de camundongos de doença glomerular.J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, descrevemos o protocolo para a realização da coloração de Schiff com ácido periódico (PAS) para avaliar as anomalias estruturais no glomérulo renal. O método de coloração PAS permite a avaliação adequada da fisiopatologia do glomérulo.

Protocolo

1. Coloração de Schiff com ácido periódico (PAS)

NOTA: A coloração PAS destacará as membranas basais das alças capilares glomerulares e o epitélio tubular. Ele permite a visualização detalhada das células glomerulares, matriz mesangial e expansão potencial e possíveis alterações do GBM (ou seja, espessamento e irregularidades).

1. Corte o córtex renal fixado em parafina e fixado em PFA usando um micrótomo de 5 μm de espessura em lâminas revestidas de poli-L-lisina. Secar a 37 °C durante 1 h. Certifique-se de que a seção não contenha dobras ou orifícios, o que pode distorcer a morfologia sob o microscópio.
2. Desparafinize as lâminas incubando duas vezes em xileno (CUIDADO, irritante; use em gabinete de exaustão) por 3 min cada, duas vezes em 100% EtOH por 3 min cada e depois uma vez em 95%, 70% e 50% EtOH por 3 min cada, tudo em temperatura ambiente. Reidratar as lâminas em dH₂O.
3. Incubar as lâminas em solução ácida periódica (CUIDADO, irritante; utilizar em câmara de exaustão) (1 g/dL) durante 5 min e, em seguida, enxaguar as lâminas em várias mudanças de dH₂O. Utilizar um recipiente com 100 ml dH₂O à temperatura ambiente.
4. Incubar as lâminas no reagente de Schiff (Parasoanilina HCl 6 g/L e metabissulfito de sódio 4% em HCl 0,25 mol/L) por 15 min em temperatura ambiente. Lave as lâminas em água corrente da torneira por 5 min.
5. Contra-core com hematoxilina por 3 s antes de enxaguar bem as lâminas em água corrente da torneira por 15 min.
   nota: Alguma otimização pode ser necessária para determinar o momento ideal para a coloração de hematoxilina.
6. Desidratar as lâminas usando o inverso do protocolo de desparafinização. Finalize com xileno.
7. Seque as lâminas ao ar e monte com mídia de montagem à base de xileno.
8. Imagem em microscópio óptico com ampliação de 400X para avaliação de estruturas glomerulares. Avalie o seguinte: espessamento e irregularidades do GBM, colapso das alças capilares, tecido fibrótico, esclerose, proliferação celular (endotelial, podócito e mesangial, ou células inflamatórias infiltrando o tufo).
   nota: Para uma avaliação abrangente da fisiopatologia glomerular, lesões em outras partes do rim devem ser avaliadas, como nos túbulos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de coloração de ácido periódico-Schiff (PAS)	Sigma-Aldrich	395B-1KT
Hematoxilina	Sigma-Aldrich	H3136
xileno	MerckMillipore	108298
Slides Poly-Prep	Sigma-Aldrich	Pág. P0425-72EA
Meio de montagem	ThermoFisher Scientific	8030
Caneta hidrofóbica	Abcam	AB2601
Miscroscópio de luz fluorescente	Leica Microsystems
Software de análise de imagem J	Imagem J