Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Realize a Cirurgia de Injeção Hidrodinâmica da Pelve Renal
- Selecione os camundongos com cuidado para a cirurgia.
NOTA: Diferenças específicas da cepa ainda não foram observadas, mas podem ser possíveis. A maioria das injeções foi nos fundos C57BL / 6 ou FVB. As injeções na pelve renal funcionam melhor em camundongos com 6 a 12 semanas de idade. Em camundongos com mais de 16 semanas, é possível uma taxa de falha de até 50% por imagem de luciferase por razões pouco claras. A mesma taxa de falha relacionada à idade foi observada para injeções hidrodinâmicas na veia da cauda no fígado, portanto, essa pode ser uma limitação geral relacionada ao princípio da injeção hidrodinâmica. Na mesma linha, outros mostraram que a injeção hidrodinâmica da veia da cauda no fígado fibrótico de ratos não é tão eficaz quanto o fígado saudável, portanto, pode ser possível que, em cenários de fibrose renal, a injeção hidrodinâmica da pelve renal não seja tão eficaz, mas isso não foi testado diretamente.
2. Prepare camundongos e seringas de DNA para cirurgia
- Anestesiar os camundongos com cetamina e xilazina.
- Coloque o equipamento de proteção individual correto exigido pela instalação animal, como avental de laboratório descartável, máscara cirúrgica e luvas de nitrilo.
- Trabalhando com 2 a 4 camundongos ao mesmo tempo, pese cada camundongo em um béquer de plástico de 500 mL em uma balança com precisão de 0,1 g. Calcule a quantidade correta de 24 mg / mL de cetamina e 2 mg / mL de xilazina diluída em solução salina normal a 0,9% para administrar a cada camundongo por injeção intraperitoneal (consulte o vídeo referenciado para obter mais informações sobre injeção intraperitoneal). Use a fórmula (50 μL + ((5 μL) x (peso (g))), ou alternativamente calcule de acordo com outra fórmula após consulta com a equipe veterinária local e a IACUC.
- Injetar o camundongo por injeção intraperitoneal por técnicas padrão. Coloque o mouse em um balde de papel até que ele fique imóvel.
NOTA: Os camundongos estão prontos para a cirurgia quando não respondem mais ao teste de beliscar o dedo do pé. Dê aos camundongos que continuam a responder ao teste de pinça do dedo do pé 20 a 30 minutos após a injeção inicial 20 a 60 μL a mais de anestésico, dependendo da força da resposta.
- Coloque o mouse em uma almofada de calor com circulação de água coberta com uma almofada azul e coloque pomada veterinária em ambos os olhos para evitar a dessecação da córnea.
- Raspe o lado esquerdo da parte de trás do mouse do ombro à garupa e do flanco à coluna com um barbeador projetado para cuidar de animais de estimação. Remova cabelos soltos e detritos.
- Prepare uma seringa separada contendo 100 μL de DNA diluído para cada camundongo anestesiado, certificando-se de que não haja bolhas de ar.
- Use uma seringa estéril de insulina U-100 de 29G x 1/2" 0,5 mL com uma agulha permanentemente conectada sem uma segurança.
NOTA: O tipo de seringa é de importância crítica. Este medidor permite uma injeção rápida. A agulha permanentemente conectada evita que a solução vaze. A presença de segurança impedirá o acesso à pelve renal. As seringas especificadas na Tabela de Materiais deslizam mais uniformemente durante a injeção do que outras marcas testadas.
- Carregue a seringa a ~120 μL e puxe o êmbolo para baixo para criar um espaço na parte superior. Bata com uma caneta até que todas as bolhas de ar subam para o topo. Segurando a agulha para cima, pressione cuidadosamente o êmbolo para remover todo o ar até que uma gota se forme na ponta da agulha. Não deve haver bolhas visíveis, pois podem causar uma embolia gasosa que matará o animal.
- Termine de pressionar o êmbolo até que haja 100 μL na seringa, esvaziando o excesso de solução de DNA no tubo de microcentrífuga original. Rotule cuidadosamente, se necessário, e coloque as seringas carregadas em uma cortina estéril para manter a esterilidade se a instalação onde o trabalho está sendo executado não permitir a reencapagem das agulhas.
3. Realize a cirurgia de injeção
- Prepare o local para a cirurgia. Coloque uma cortina estéril sobre a almofada térmica e esvazie as ferramentas cirúrgicas estéreis na cortina estéril sem tocá-las. Pegue o mouse e coloque-o no campo de visão. Ajuste a iluminação para iluminar a área.
- Remova três cotonetes anti-sépticos de clorexidina a 3,15% e álcool isopropílico a 70% das embalagens e coloque perto do animal.
- Coloque luvas cirúrgicas estéreis. Trabalhando em movimentos circulares começando no local da incisão, esfregue o animal com um novo cotonete de clorexidina/álcool três vezes.
- Localize o local da incisão conforme mostrado na Figura 1A. Beliscando a pele com uma pinça, use uma tesoura para fazer um corte na camada de pele a aproximadamente 1 cm da coluna e abaixo da caixa torácica. Quando o local de corte tiver aproximadamente 1 cm de comprimento, faça um local de corte semelhante abaixo, na camada muscular.
NOTA: Faça a incisão no comprimento certo para permitir que o rim passe mal pela incisão e, em seguida, seja mantido no lugar pela própria incisão. Uma incisão muito pequena e o rim não pode ser exposto; muito grande e o rim deslizará continuamente de volta para a cavidade abdominal.
- Localize o rim.
nota: Pode ser visível entre o tecido adiposo branco. O baço também está localizado no lado esquerdo do animal. A cor desses órgãos pode ser visualmente diferenciada, pois o baço é marrom escuro, enquanto o rim é vermelho-alaranjado escuro. Não é desejável manipular o baço, pois ele pode ser facilmente rompido.
- Sem tocar no rim, exponha-o suavemente da cavidade abdominal, exercendo uma pressão constante e suave no abdômen com os dedos (Figura 2C). Use uma pinça fechada para empurrar suavemente os órgãos indesejados de volta para o abdômen, se necessário. Não use pinças abertas, pois isso pode danificar os rins ou outros órgãos.
- Uma vez que o rim esteja fora do abdômen, separe-o suavemente da gordura circundante apenas o suficiente para visualizar a pelve renal, um pequeno ponto branco (Figura 1B). Empurre o excesso de gordura para um lado ou remova, se necessário. Certifique-se de não remover a glândula adrenal, localizada perto do pólo superior do rim, ou a cápsula renal.
- Usando uma pinça fechada para empurrar para baixo o lado direito do rim de modo que a pelve renal permaneça à vista, segure a seringa de insulina carregada com a mão direita e segure-a paralelamente à superfície de trabalho com a agulha apontada para a pelve renal (Figura 2E). Insira a agulha cuidadosamente na pelve renal do rim imobilizado, conforme mostrado na Figura 1B.
- Injetar a solução rapidamente em três segundos. Cerca de um terço do rim pode clarear e mudar de cor para branco.
NOTA: É comum observar acúmulo de líquido na cápsula renal após a injeção, bem como a formação de um hematoma. Algum dano é necessário para atingir um nível suficiente de transfecção de DNA para detecção.
- Mantenha a agulha no lugar por aproximadamente 10 s para evitar o refluxo da solução. Em seguida, remova a agulha com cuidado e lentamente. Retorne o órgão à cavidade abdominal esticando suavemente o local da incisão e usando uma pinça fechada.
- Suturar a camada muscular do animal com suturas absorvíveis 5-0, colocando 2–4 nós independentes.
- Suturar a camada de pele do animal com pontos de náilon inabsorvíveis 5-0 ou 6-0, colocando 2 a 4 nós independentes.
NOTA: As ferramentas cirúrgicas podem ser reutilizadas após serem colocadas em um banho de esferas estéreis e resfriadas.
