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1. Implantação de células
Para implantar células Renca intrarrenalmente, prepare as células Renca em uma suspensão unicelular a 2 x 106 células/mL em Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
- Remova as células Renca aderentes do frasco de cultura de tecidos usando tripsina a 0,25% em HBSS. Após ~ 5 min, adicione RPMI completo ao frasco para neutralizar a tripsina e transfira as células para um tubo de centrífuga para lavagem. Centrifugar as células a 300 g de força centrífuga relativa (rcf x g) durante 5 min a 25 °C.
- Transvasar o sobrenadante e ressuspender as células em HBSS. Conte as células usando um hemocitômetro e ajuste o volume com HBSS para produzir 2 x 106 células/mL.
- Puxe as células para uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 18 para evitar tensão de cisalhamento nas células. Substitua a agulha de calibre 18 por uma agulha de calibre 28 antes da injeção das células tumorais. Uma injeção de 0,1 mL fornece 2 x 105 células no rim.
2. Preparação da Área Cirúrgica
- Prepare uma área cirúrgica estéril em um gabinete de biossegurança, colocando uma cortina cirúrgica estéril sobre uma almofada de aquecimento. Reúna todos os suprimentos, incluindo fórceps, bisturi, tesoura, colírio, anti-séptico de iodopovidona a 5% e gaze estéril. Autoclave todos os instrumentos antes de usar.
- Realize a cirurgia usando uma técnica de ponta asséptica. Reesterilize os instrumentos entre os animais com um esterilizador de contas. Use luvas estéreis, jaleco e máscara facial.
3. Preparação Animal
- Anestesiar os camundongos com cetamina / xilazina (87,5 mg / kg e 12,5 mg / kg, respectivamente, i.p.) de acordo com as diretrizes institucionais. Determine a profundidade do anestésico realizando uma pinça no dedo do pé.
- Quando o animal for considerado não responsivo, prepare o local da injeção (por exemplo, flanco esquerdo) em camundongos Balb / c arrancando (com os dedos) ou raspando (usando uma tesoura) o pelo.
- Mova os camundongos da área de preparação da cirurgia (por exemplo, a gaiola de alojamento) para a área cirúrgica e aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Limpe generosamente o local da incisão preparado com anti-séptico de iodopovidona a 5%.
- Injete cloridrato de bupivacaína (0,1 mL de uma solução de 2,5 mg / mL, s.c.) na área onde a incisão será feita como analgesia pré-operatória.
- Faça uma única incisão (~1,0 a 1,5 cm) no flanco esquerdo do animal usando um bisturi estéril ou tesoura com cuidado para não penetrar no peritônio. Separe a derme do peritônio com uma tesoura estéril. Enxugue o local da incisão com gaze de algodão estéril para remover qualquer sangue.
- Segure o mouse com as duas mãos, usando a mão esquerda para segurar a cabeça e a mão direita para apoiar o flanco.
- Identifique o baço através do peritônio e, com um dedo da mão direita, palpe o camundongo por baixo; o rim agora deve ser visível através do peritônio. Mantenha um aperto firme do animal para fornecer tensão no peritônio e no rim.
- Peça a uma segunda pessoa que injete as células tumorais (preparadas na seção 1.2) através do peritônio intacto no centro do rim usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 28. Forneça lentamente 0,1 mL (2 x 105) de células. Depois que as células forem injetadas, segure a agulha no lugar por 5 a 10 segundos para reduzir o refluxo das células. É importante observar a necessidade de extrema cautela durante esta etapa, pois a pessoa que injeta as células aproximará a agulha dos dedos da pessoa que segura o mouse.
- Remova a agulha e feche a incisão com uma fina camada de adesivo tecidual de cianoacrilato.
- Coloque o animal de volta em uma gaiola limpa com uma toalha de papel estéril. Deixe os animais se recuperarem em uma almofada de aquecimento. Não deixe os animais sozinhos durante o período de recuperação. Não devolva os animais às condições normais de alojamento até que estejam na posição vertical e esternal. Siga as orientações institucionais em todos os procedimentos com animais de laboratório.