Análise de Expressão de Proteínas Baseada em Matrizes de Proteínas de Fase Reversa: Um Procedimento para Quantificação Simultânea da Expressão de Múltiplas Proteínas do Lisado Celular

Abstract

Fonte: O'Mahony, F. C. et al. O uso de matrizes de proteínas de fase reversa (RPPA) para explorar a variação da expressão de proteínas em cânceres de células renais individuais. (2013)

Este vídeo demonstra a metodologia para realizar Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) para estudar padrões de expressão de proteínas a partir de lisado celular. No RPPA, o lisado contendo uma mistura de proteínas é impresso em lâminas de nitrocelulose e as proteínas de interesse são analisadas usando anticorpos marcados com fluorescência.

Protocol

1. Impressão RPPA

1. Os lisados de proteínas foram detectados em lâminas de vidro revestidas de nitrocelulose (Fastslides-Whatman) usando um observador robótico MicroGrid II. As lâminas usadas continham 2 almofadas nas quais as amostras foram localizadas. Cada almofada foi manchada com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem slides de 1, 8 e 16 almofadas. Quanto maior o número de almofadas, menor o número de amostras que podem ser vistas em cada uma.
2. Uma série de cinco diluições de 2 vezes foi feita de cada amostra e cada uma foi então manchada em triplicata (resultando em um total de 15 pontos por amostra).

2. Detecção de proteína RPPA

1. Lâminas úmidas em excesso de tampão de bloqueio de LiCor (diluído 50:50 em PBS). Incube em RT por 1 hora em uma plataforma de balanço.
2. Prepare 800 μL de anticorpos primários em LiCor Blocking Buffer (diluído 50:50 em PBS) nas concentrações desejadas e mantenha em gelo.
3. Monte as lâminas (i) no Chip Clip de quadro único ou (ii) no suporte de lâmina de quatro baias 'FastFrame' para que uma vedação firme seja formada entre a lâmina e a câmara de incubação.
4. Remova o tampão residual dos poços e adicione 600 μL de anticorpo primário aos respectivos poços.
5. Coloque a lâmina e a câmara em uma caixa úmida selada e incube na plataforma de balanço durante a noite a 4 °C.
6. Compõem 0,1% de PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL PBS).
7. Remova as lâminas da câmara fria e remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada poço.
8. Adicione 600 μL de PBS-T e lave as lâminas na plataforma de balanço em RT por 5 min (X3).
9. Prepare anticorpos secundários marcados com fluorescência diluindo em Odyssey Blocking Buffer (diluído 50:50 em PBS) 0,01% SDS na diluição de 1:2.000 (1 μL/2 mL) em primeira instância.
10. Remova o tampão dos poços e adicione 600 μL de anticorpos secundários marcados com fluorescência aos respectivos poços. Incubar anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave; É importante proteger a membrana da luz até que ela seja finalmente digitalizada.
11. Remover os anticorpos secundários do alvéolo e lavar brevemente (x3) em 600 μL de PBS-T à temperatura ambiente. Remova a lâmina do transportador, transfira para um recipiente adequado e lave o excesso de PBS-T por 15 min, mantendo a membrana no escuro.
12. Remova o PBS-T e lave a membrana com PBS em temperatura ambiente por 15 min para remover o Tween-20 residual, novamente mantendo a membrana no escuro.
13. Seque o Fastslide em forno a 50 °C por 10 min e depois digitalize no scanner Li-Cor Odyssey. Mantenha a lâmina no escuro até que tenha sido digitalizada.
14. Varrer a lâmina a 680 nm e/ou 800 nm, dependendo do(s) anticorpo(s) secundário(s) utilizado(s). Para detecção em duas cores, sempre use anticorpos secundários altamente adsorvidos para minimizar a reatividade cruzada. A seleção cuidadosa de anticorpos primários e secundários é necessária para a detecção em duas cores. De importância primordial é a seleção de diferentes espécies hospedeiras (por exemplo, coelho e camundongo) para os dois anticorpos primários. Isso permite a discriminação por anticorpos secundários anti-coelho e anti-camundongo que são marcados com corante com espectros de emissão facilmente distinguíveis.
15. Os arquivos de imagem são salvos como arquivos .tiff. A Figura 1 mostra a imagem dos arquivos digitalizados.

Results

Figura 1. Fluxograma do processo de varredura RPPA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tritão X-100	Tritão-X	T8787
Tampão de bloqueio Li-Cor Odyssey	Li-Cor	927-40000
Observador robótico MicroGrid II	Biorrobótica
Suporte de slides de quatro baias FastFrame	O que homem	10486001
FAST Slide - 2 almofadas	O que homem	10485317
IRDye 680LT IgG anti-rato de cabra	Licor	Rolamento 926-68020
IRDye 800CW IgG anti-coelho de cabra	Licor	Telefone: 926-32211