Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Soluções
- Faça uma solução estoque de 50x de meio embrionário E3 misturando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada e armazene em RT.
- Faça uma solução estoque de 50x de meio embrionário E3 misturando 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2 e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada e armazene em RT.
- Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilua a solução estoque 50x de estoque de embriões E3 para uma solução de trabalho 1x com água destilada e, em seguida, adicione 200 μl de azul de metileno a 0,05% a cada 1 L de 1x E3 para atuar como fungicida e armazene em RT.
- Faça uma solução de bloqueio de pigmentação de meio embrionário E3 com 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) combinando 40 mL do estoque 50x E3 com 0,06 mg de PTU. Em seguida, eleve o volume para um total de 2 L com água destilada.
- Agite o E3/PTU O/N em RT para colocar o pó de PTU em solução. Em seguida, armazene o E3/PTU em RT.
nota: O E3/PTU tem uma vida útil de aproximadamente uma semana, e as soluções mais antigas serão menos eficazes no bloqueio do desenvolvimento de pigmentação em larvas de peixe-zebra.
- Faça uma solução anestésica de 0,2% de Tricaína (MS-222) adicionando 1 g de Tricaína a 500 mL de água destilada e ajuste o pH para 7,2 com 1 M Tris, pH 9,5.
2. Preparação de ferramentas
- Prepare uma ferramenta manipuladora de embriões, usada para posicionar embriões para microinjeção, prendendo uma ponta de carregamento de gel na extremidade de uma agulha de dissecação reta de 5" e prenda com fita adesiva ou supercola.
- Prepare as agulhas de microinjeção usando um extrator de agulha, colocando primeiro um vidro de borossilicato de 10 cm polido com filamento no instrumento e prenda o vidro de borossilicato apertando as alças.
- Puxe o vidro de borossilicato para formar agulhas cônicas finas. Use as seguintes configurações: calor 540, tração 245, velocidade 200 e tempo 125.
- Coloque as agulhas dentro de uma placa de Petri, suspendendo-as em uma tira de massa de modelar para proteger as pontas das agulhas, e mantenha a placa coberta para evitar o acúmulo de poeira.
- Para terminar de preparar a agulha para microinjeções, use uma lâmina de barbear ou uma ponta fina de pinça para cortar a extremidade puxada da agulha para criar uma ponta de injeção angular afiada com um diâmetro de aproximadamente 0,05–0,1 mm.
- Para fazer a bandeja de microinjeção, prepare uma solução de agarose/E3 a 1,5% em um frasco Erlenmeyer de 100 mL e dissolva a agarose aquecendo o E3 até ferver no micro-ondas e deixe esfriar em RT por aproximadamente 10 min.
- Despeje a solução resfriada de agarose/E3 em uma placa de Petri para fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Quando este estiver solidificado, despeje uma segunda camada com uma profundidade de aproximadamente 0,3 cm e insira o embrião pré-fabricado, bem moldado e deixe a agarose solidificar em RT.
nota: Ao inserir o molde na camada superior de ágar/E3, coloque o molde no ágar em um ângulo para diminuir o número de bolhas de ar.
- Quando toda a bandeja de microinjeção estiver endurecida, levante o molde do embrião pré-fabricado lenta e cuidadosamente usando uma escópula, encha o prato com a solução E3 e armazene a 4 °C.
3. Microinjeção de solução de nefrotoxina
- No dia da injeção, prepare a solução de nefrotoxina desejada junto com o controle apropriado do veículo.
- Vortex ou misture suavemente para garantir que o(s) medicamento(s) esteja(m) em solução, verificando as laterais do tubo e a parte superior da coluna d'água.
nota: As soluções de nefrotoxinas podem ser preparadas para conter vestígios de dextrana conjugada com fluorescência para monitorar a eficiência da microinjeção e também avaliar a depuração renal em pontos de tempo subsequentes.
- Carregue uma agulha de microinjeção aparada com ~ 2–3 μL da nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fino na parte de trás da agulha e suspenda a agulha verticalmente com um pedaço de fita adesiva para permitir que a solução preencha a ponta da agulha aparada por gravidade.
- Quando a ponta da agulha estiver cheia, prenda a agulha carregada no micromanipulador.
- Teste o volume de microinjeção colocando uma gota de óleo mineral em uma lâmina micrométrica e injete no óleo para avaliar o tamanho da gota. Um volume de injeção de 500 pl tem um diâmetro de 0,1 mm.
- Remova a placa de embriões da incubadora e anestesia adicionando aproximadamente 5 mL de tricaína a 0,2% à placa de embriões.
- Para garantir a anestesia completa, toque suavemente o embrião com a ponta da ferramenta manipuladora de embriões. A falta de movimento indica anestesia suficiente.
- Após a anestesia bem-sucedida, transfira os embriões para o molde de injeção com uma pipeta de transferência.
- Manobre cada embrião em um poço diferente do molde, colocando a cabeça na área mais profunda do poço, de modo que o tronco repouse ao longo da depressão e a cauda se projete para fora da depressão.
- Insira a agulha cheia no micromanipulador e posicione a ponta da agulha ao lado de um embrião.
- Insira suavemente a agulha no vaso da cauda movendo o joystick para frente e pressione o pedal para aplicar a microinjeção.
nota: A injeção bem-sucedida pode ser medida observando o líquido entrar em circulação. Além disso, a co-injeção do nefrotóxico com dextrano conjugado com fluorescência permite que o pesquisador verifique a injeção bem-sucedida após o procedimento.
- Puxe suavemente o joystick para remover a agulha do embrião.
- Após a injeção, transfira os embriões para um prato limpo e enxágue para remover a tricaína e substitua por E3 / PTU fresco.
- Incubar o embrião até o ponto de tempo desejado para avaliar a morfologia, que pode ser documentada por fotografia em meios de montagem de metilcelulose ou processo para análise experimental, conforme desejado.
nota: A recuperação dos embriões deve ser avaliada para determinar a porcentagem de indivíduos com edema, o que comumente indica lesão renal.
