Preparação de montagem plana de rim: um procedimento para dissecar e preparar uma montagem plana para análise microscópica de rim de peixe-zebra adulto

Resumo

Fonte: McCampbell, K. K. et al. Análise da composição e função do néfron no rim do peixe-zebra adulto.J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra a dissecação e preparação de uma montagem plana do rim de peixe-zebra adulto. A montagem plana preparada pode ser visualizada ao microscópio para análise de amostras.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Dissecção e preparação de montagem plana do rim de peixe-zebra adulto a partir de uma amostra animal não fixada para visualizar a marcação fluorescente de dextrano do túbulo proximal

1. Eutanasiar o peixe-zebra adulto injetado com dextrana, colocando-o em um prato com 0,2% de tricaína pH 7,0 por 4–5 min.
   nota: Certifique-se de que o peixe foi sacrificado antes de prosseguir, monitorando cuidadosamente se as guelras pararam de se mover e o coração parou de bater.
2. Usando uma colher de plástico, retire o peixe da solução de Tricaína, decanta a solução e coloca o animal sobre um lenço de papel ou toalha de papel.
3. Use uma tesoura de dissecação afiada para fazer um corte atrás do opérculo branquial e remova a cabeça.
4. Abra imediatamente o corpo do peixe com a tesoura de dissecação, fazendo uma longa incisão ventral da cabeça até a base da barbatana caudal.
5. Remova os órgãos internos do peixe usando uma pinça fina.
6. Use agulhas de dissecção superfinas para prender as paredes do corpo para permitir a visualização do órgão renal, que é aderente à parede dorsal do animal.
7. Use uma pinça fina para separar o rim da parede dorsal.
8. Coloque delicadamente o rim em um frasco de vidro de 5 mL contendo 1X PBS e lave 3 vezes com 3-5 mL de 1X PBS fresco por 5 min cada.
   nota: O uso de um frasco de vidro para manuseio de amostras de rim adulto facilita a visualização do tecido e permite lavagens com grandes volumes (em relação à massa do tecido) de aproximadamente 3 a 5 mL. Alternativamente, uma placa de cultura de células de 12 poços pode ser usada. Enquanto um tubo de microcentrífuga de plástico pode ser usado, os tubos de tamanho padrão (1,5 mL) podem restringir a lavagem.
9. Remova o rim com uma pipeta de transferência e coloque em uma lâmina de vidro limpa com 1–2 gotas de 1X PBS.
10. Use uma pinça fina, achate o rim na lâmina, certificando-se de que nenhum tecido tenha se enrolado ou virado sobre si mesmo.
    nota: Alternativamente, uma ferramenta de fio de tungstênio pode ser usada para fazer pequenas incisões no tecido conjuntivo para facilitar o posicionamento achatado do rim.
11. Coloque pequenos pedaços de massa de modelar em cada canto de uma lamínula de vidro de 18 x 18 mm e coloque lentamente a lamínula no rim.
    nota: Incline levemente a lamínula durante a colocação para minimizar a retenção de bolhas de ar na solução. Os divots de argila de modelagem têm aproximadamente 2 mm de diâmetro (Figura 1A). Alternativamente, divots de graxa a vácuo podem ser substituídos em vez de massa de modelar. Adicione uma gota adicional de 1X PBS para preencher o espaço entre a lamínula e a lâmina de vidro, se necessário.
12. Observe e/ou obtenha imagens do rim colocando a lâmina de vidro no campo de visão em um estereomicroscópio ou microscópio composto com o filtro apropriado.

Resultados

Figura 1. Preparação e aplicação de montagem plana de rim de peixe-zebra adulto para visualizar a captação de dextrana conjugada no segmento PCT de néfrons renais. (UMA)Imagem de campo claro de uma preparação de montagem plana de espécime renal, na qual o órgão foi posicionado sobre uma lâmina de vidro, com uma lamínula colocada no topo do tecido que está apoiado em quatro recortes de massa de modela...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1X PBS			Feito diluindo 10 X PBS em água destilada.
Fórceps Fino	Roboz	RS-1050	Padrão de pinça Dumont #55
Corrediça de vidro	Thermo-Fisher	Nº 4445	Geada Branca
Lamínula de vidro	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 milímetros
Argila de modelagem	Hasbro	Playdoh	Outras argilas de modelagem podem ser substituídas e funcionar de forma semelhante.
Suporte deslizante	Thermo-Fisher	12-587	Opcional: bandeja de papelão para armazenar as lâminas planas.
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Azul GFP/DAPI; 83457 P-Dotar GFP/FITC; 83457 P-TRITC	O conjunto de filtros utilizado foi o seguinte: O filtro Hoechst/DAPI foi utilizado para a detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e antiGFP. O filtro TRITC foi usado para detecção de dextrana-fluoro-rubi, PI e DBA.
Microscópio composto	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red	O conjunto de filtros utilizado foi o seguinte: O filtro Hoechst/DAPI foi utilizado para a detecção de DAPI, iodeto de propídio, azul de cascata de dextrana e fosfatase alcalina. O filtro GFP/FITC foi usado para detecção de dextran-FITC, amarelo de lúcifer dextrano e antiGFP. O filtro Texas Red foi usado para detecção de dextrana-fluoro-rubi, PI e DBA.